【摘 要】
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目的:1.探索毛蕊异黄酮作用于星形胶质细胞后其对细胞凋亡或增殖的影响。2.探讨毛蕊异黄酮抑制脊髓星形胶质细胞凋亡的机制,为后续的动物实验提供理论基础,也为临床治疗急性脊髓损伤提供方向。方法:1.在超净台上行手术将SD乳鼠脊髓组织取出,随后分离制成悬液,置入培养四箱进行培养、传代,每日观察细胞的形态变化,传至第三代后采用免疫荧光检测GFAP进行鉴定。2.分别加入5μmol/ml、10μmol/ml或
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目的:1.探索毛蕊异黄酮作用于星形胶质细胞后其对细胞凋亡或增殖的影响。2.探讨毛蕊异黄酮抑制脊髓星形胶质细胞凋亡的机制,为后续的动物实验提供理论基础,也为临床治疗急性脊髓损伤提供方向。方法:1.在超净台上行手术将SD乳鼠脊髓组织取出,随后分离制成悬液,置入培养四箱进行培养、传代,每日观察细胞的形态变化,传至第三代后采用免疫荧光检测GFAP进行鉴定。2.分别加入5μmol/ml、10μmol/ml或20μmol/ml毛蕊异黄酮预处理髓星形胶质细胞12h,然后加入100μmol/ml H2O2处理24h造成氧化损伤模型,CCK8检测各组细胞增殖情况选择合适的毛蕊异黄酮处理浓度。3.实验主要分为空白组、模型组、模型+毛蕊异黄酮预处理组、模型+毛蕊异黄酮预处理+抑制剂LY294002组、模型+毛蕊异黄酮处理+抑制剂Stattic组等5组,各组星形胶质细胞的增殖情况采用CCK8法检测,采用流式细胞仪检测细胞增殖凋亡情况,免疫荧光检测各组星形胶质细胞中的Brdu水平;Western blot检测各组细胞中p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、GP130、IL-6的蛋白表达水平。结果:1.使用原代分离的技术获取乳鼠脊髓星形胶质细胞后采用免疫荧光技术,通过检测细胞特征基因GFAP的表达,可以获得纯度较高的星形胶质细胞。2.选用100μmol/ml浓度的H2O2,配置乳鼠星形胶质细胞的氧化损伤模型。然后再各孔分别加入5、10、20μmol/ml毛蕊异黄酮预处理,结果发现,20μmol/ml毛蕊异黄酮处理氧化损伤模型后可大幅度增加星形胶质细胞增殖活力,因此选择使用20μmol/ml毛蕊异黄酮进行后续实验。3.与对照组比较,经H2O2处理后,细胞增殖活力明显降低,与H2O2处理组相比,在加入毛蕊异黄酮后,细胞的增殖活力有明显提升;与毛蕊异黄酮干预组相比,加入PI3K抑制剂ly294002和STAT3抑制剂stattic后,有明显的抑制星形胶质细胞增殖的作用。Brdu免疫荧光结果可知,与空白组相比较,加入H2O2后,星形胶质细胞的数量明显减少,这也侧面证明星形胶质细胞的氧化损伤模型制作成功,与H2O2处理组相比,毛蕊异黄酮在干预后显著增强了星形胶质细胞的增殖;与毛蕊异黄酮干预组相比,加入PI3K抑制剂ly294002和STAT3抑制剂stattic后,星形胶质细胞的增殖受到明显抑制。4.流式周期检测结果显示同对照组相比,H2O2显著促进了细胞凋亡,与H2O2处理组相比,毛蕊异黄酮干预后显著抑制了细胞凋亡;与毛蕊异黄酮干预组相比,PI3K抑制剂ly294002和STAT3抑制剂stattic在促进了细胞凋亡方面,有明显增强。5.与空白组比较,氧化损伤的模型组中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、GP130、IL-6的表面相关蛋白表达水平明显增加,加入毛蕊异黄酮及相关抑制剂处理各组细胞后发现,星形胶质细胞表面的p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、GP130、IL-6的蛋白表达水平明显较空白组降低。结论:1.从新生SD乳鼠脊髓组织中可分离原代星形胶质细胞,应用差速贴壁的方法可进一步提纯星形胶质细胞。2.在星形胶质细胞中加入H2O2后,星形胶质细胞的胞体发生了显著变化,且出现增殖活力显著下降和自发的凋亡现象;在加入毛蕊异黄酮后可发现,毛蕊异黄酮可以对过氧化氢损害后的SD乳鼠脊髓星形胶质细胞具有一定的保护作用,具体表现在可增强星形胶质细胞的增殖活力。3.毛蕊异黄酮通过抑制PI3K/AKT通路、JAK/State通路的磷酸化促进氧化损伤的星形胶质细胞增殖并抑制其凋亡,从而减轻脊髓损伤后损伤区域的进一步扩大,进而起到神经保护的作用。
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