慢性痛的患病率逐年增加,严重危害患者的身心健康。尽管针对慢性痛不断开发出新的药物,但临床效果仍然不尽如人意,其中,性别已成为重要的影响因素。因此,镇痛作用的性别差异逐渐引起大众的广泛关注。大麻素已被用于疼痛治疗长达数千年。在美国,慢性痛属于应用大麻最常见的适应证。临床试验及动物实验均表明,使用大麻素存在雌性比雄性更敏感的现象,然而大麻素镇痛的雌雄差异机制仍然不清楚。大麻素1型受体（Cannabinoid 1 receptor,CB1R）是外源及内源性大麻素最重要的受体,广泛分布于中枢神经系统。中央导水管周围灰质（Periaqueductal gray,PAG）及其向延髓头端腹内侧区（Rostral ventromedial medulla,RVM）和脊髓背角的下行投射（PAG-RVM-SDH回路）构成最经典的下行疼痛调节系统,是内源性镇痛系统的关键通路。中央导水管周围灰质腹外侧区（Ventrolateral periaqueductal gray,vlPAG）作为该下行抑制整合的关键节点,在外源及内源性大麻素通过激活CB1R发挥内源性镇痛中起到至关重要的作用。此外,vlPAG还受上游内侧前额叶皮质（medial prefrontal cortex,mPFC）等重要脑区的调控。尽管科学家们已对CB1R在两性小鼠脑内的表达以及内源性大麻素系统（Endocannabinoid system,ECS）在中枢神经系统中的功能进行了不断的探索,并强调了vlPAG和mPFC中CB1R在大麻素调控痛行为中的重要性。然而,大麻素激活CB1R发挥镇痛作用的过程是否存在雌雄差异仍然不清楚,vlPAG和mPFC中CB1R的表达是否存在细胞类型和性别特异性目前尚无报道。因此,本研究首先利用疼痛行为学、药理学、免疫组化和原位杂交等方法检测坐骨神经慢性压迫损伤（Chronic constriction injury,CCI）模型中是否存在小鼠疼痛的性别差异现象,调控vlPAG内CB1R是否出现性别差异,以及vlPAG内CB1R的分布是否存在细胞类型和性别特异性。其次,利用转基因技术结合病毒注射和化学遗传学方法将上述性别差异在行为学水平上进行验证;进一步,我们利用转基因技术结合电生理和光遗传方法将上述性别差异在突触水平上进行了验证。最后,mPFC作为vlPAG的上游,我们利用同样的方法检测mPFC-vlPAG通路上的CB1R是否存在性别特异性分布。揭示大麻素介导镇痛的性别差异,可以为探索镇痛药物治疗慢性疼痛存在的性别差异现象提供结构和功能基础。实验一调控小鼠vlPAG内CB1R对疼痛作用的性别差异现象目的:阿片等镇痛药物的镇痛作用雌雄差异的现象广泛存在,随着大麻素类药物逐渐被应用于疼痛治疗,大麻素在女性以及雌性动物中产生更强镇痛作用的现象也逐渐引起人们的关注。尽管大麻素系统已被证实在雄性动物vlPAG脑区参与镇痛作用,但大麻素镇痛雌雄差异现象的机制并不清楚。本部分实验应用疼痛行为学、脑内核团定位注射、免疫荧光和原位杂交等方法旨在探讨调控vlPAG区CB1R对于大麻素镇痛作用以及雌雄差异的影响。方法:1.利用von Frey纤维丝测量小鼠的机械性缩足反射阈值（Paw Withdrawal Mechanical Threshold,PWMT）从而评估野生型（wide-type,WT）小鼠的点状机械性痛觉超敏（Punctate mechanical allodynia）,利用毛刷测量小鼠Dynamic评分反映小鼠动态机械性痛觉超敏（Dynamic mechanical allodynia）,利用Hargreaves法测量小鼠的热缩足反射潜伏期（Paw Withdraw Thermal Latency,PWTL）,观察野生型雌性和雄性小鼠在CCI疼痛模型中上述疼痛行为学变化;并将雌性小鼠按照雌激素水平高低划分为发情前期以及发情间期,观察雌性小鼠在CCI疼痛模型中上述疼痛行为学变化。2.分别给予雌、雄小鼠vlPAG脑区微注射CB1R激动剂ACEA或CB1R拮抗剂NESS0327,观察大麻素受体在雌雄小鼠疼痛行为反应中的作用。3.通过免疫组化以及原位杂交方法分别观察vlPAG区抑制性神经元（GABA能神经元）以及兴奋性神经元（Ca MKIIα神经元）上CB1R的表达分布情况。结果:1.野生型雌、雄小鼠CCI术后均诱发机械性痛觉超敏和热痛觉过敏,但无明显雌雄差异;将雌性动物按照动情周期划分为发情前期以及发情间期两组后,CCI均可诱发明显的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏,亦无明显周期性差异;2.而当给予小鼠vlPAG区CB1R激动剂ACEA后,与Vehicle组相比,雌性小鼠vlPAG内CB1R激活能更大程度上缓解CCI诱发的机械性痛觉超敏,并且此作用较雄性更为明显（p＜0.05,n=8）;给予小鼠vlPAG区CB1R拮抗剂NESS0327后,雌性小鼠表现出较雄性小鼠更严重的机械性痛觉超敏现象（p＜0.05,n=8）。3.免疫组化结果显示,与雄性小鼠相比,雌性小鼠vlPAG内GABA能神经元上表达更多CB1R（p＜0.001,n=4）,原位杂交结果也显示Gad2-td Tomato与CB1R-m RNA共标率在雌性小鼠中要高于雄性小鼠（p＜0.001,n=4）。而80%以上Ca MKIIα+神经元与CB1R共定位,雄性小鼠和雌性小鼠之间无统计学差异（p=0.1292,n=4）。结论:野生型小鼠CCI术后机械性痛觉超敏无显著的雌雄差异现象,而调控vlPAG内CB1R时小鼠呈现出明显的雌雄差异现象,并且这种现象极有可能是vlPAG内GABA能神经元上CB1R表达的性别差异所介导,CB1R很可能参与了大麻素诱导镇痛作用的性别差异。实验二vlPAG内GABA能神经元CB1R对小鼠镇痛作用的性别差异目的:上述研究初步揭示vlPAG内GABA能神经元上CB1R表达的性别特异性是决定调控该脑区CB1R表现出性别差异的关键,在本部分实验中我们将继续通过转基因技术,病毒注射和化学遗传学等方法,从行为学方面证实vlPAG内GABA能神经元上的CB1R确实参与了大麻素镇痛作用的雌雄差异。方法:1.繁育CB1R-flox小鼠,通过PCR方法鉴定小鼠基因型。2.将r AAV-Dlx5/6-mCherry或者r AAV-Dlx5/6-Cre-mCherry病毒注射到CB1R-flox小鼠vlPAG脑区,以标记vlPAG内GABA能神经元或者敲除vlPAG中GABA能神经元上CB1R,待病毒表达3周后,首先利用原位杂交的方法验证Dlx5/6启动子的特异性,然后验证了GABA能神经元CB1R敲除效率,并测量小鼠基础运动功能和基础痛行为学后行CCI造模,观察CCI模型后疼痛行为学变化。3.向CB1R-flox小鼠vlPAG脑区注射r AAV-Ca MKIIα-mCherry或者r AAV-Ca MKIIα-Cre-mCherry病毒,标记vlPAG内Ca MKIIα阳性神经元或者敲除Ca MKIIα+神经元上CB1R,待病毒表达3周后,首先利用原位杂交的方法验证了Ca MKIIα启动子的特异性,然后验证Ca MKIIα神经元上CB1R敲除率,测量小鼠基础运动功能和疼痛行为学后行CCI造模,观察术后疼痛行为学变化。4.利用Cre-lox P系统将Cre依赖的h M4Di（r AAV-Dlx5/6-h M4D（Gi）-mCherry-WPREs,AAV 2/9）或对照病毒（r AAV-Dlx5/6-mCherry-WPRE-h GH p A,AAV2/9）注射至成年雄性和雌性小鼠vlPAG脑区。病毒表达3周后,首先验证病毒表达是否成功,然后行CCI造模,在CCI后第10天以及21天腹腔注射氯氮平-N-氧化物（Clozapine-N-oxide,CNO）并观察小鼠疼痛行为学变化。结果:1.成功繁育CB1R-flox小鼠。2.根据Cre-lox P系统将r AAV-Dlx5/6-mCherry或者r AAV-Dlx5/6-Cre-mCherry病毒注射到雌性和雄性CB1R-flox小鼠vlPAG脑区后,利用原位杂交的方法将Dlx5/6-mCherry与Gad2-m RNA进行共标,结果显示有68.0±1.2%Dlx5/6-mCherry神经元与Gad2-m RNA共标,有67.0±0.8%Gad2-m RNA阳性神经元与Dlx5/6-mCherry共标。进而对敲除率进行验证,结果显示GABA能神经元上CB1R分别有46.53%和57.63%被敲除,敲除该受体后对雌性小鼠（Dlx5/6-cre-mCherry vs.Dlx5/6-mCherry,p=0.96,n=10）或雄性小鼠（Dlx5/6-cre-mCherry vs.Dlx5/6-mCherry,p=0.88,n=10）的运动功能无影响。并且,基础状态下的疼痛行为学结果显示,vlPAG中GABA能神经元上CB1R敲除对雄性小鼠或雌性小鼠基础状态下的点状机械性痛觉超敏、动态机械性痛觉超敏和热痛觉过敏均无影响。在CCI造模后,雌性小鼠和雄性小鼠均表现出明显的痛觉超敏现象,但在Dlx5/6-Cre-mCherry组中,雌性小鼠在CCI后第5天（雌性vs.雄性,p=0.0439,n=8）,第10天（雌性vs.雄性,p=0.0395,n=8）和第14天（雌性vs.雄性,p=0.0238,n=8）呈现出比雄性小鼠更强烈的点状机械性痛觉超敏现象;雌性小鼠在CCI后第10天（雌性vs.雄性,p＜0.01,n=8）,第14天（雌性vs.雄性,p＜0.05,n=8）呈现出比雄性小鼠更剧烈的动态机械性痛觉超敏。3.将r AAV-Ca MKIIα-mCherry或者r AAV-Ca MKIIα-Cre-mCherry病毒注射至CB1R-flox小鼠vlPAG脑区后,利用原位杂交的方法将Ca MKIIα-mCherry与v Glut2-m RNA进行共标,结果显示有92.0±0.6%Ca MKIIα-mCherry神经元与v Glut2-m RNA共标,有89.0±0.9%v Glut2-m RNA阳性神经元与Ca MKIIα-mCherry共标。进而对敲除率进行验证,结果显示雌性和雄性小鼠中分别有53.7%和38.17%的Ca MKIIα+能神经元CB1R被敲除,敲除该受体后对雌性小鼠（Ca MKIIα-Cre-mCherry vs.Ca MKIIα-mCherry,p=0.8340,n=10）和雄性小鼠（Ca MKIIα-Cre-mCherry vs.Ca MKIIα-mCherry,p=0.6379,n=10）的运动功能无影响。并且,对雌性和雄性小鼠基础状态下的疼痛行为学无影响。CCI后雌性（PWMT:p=0.5813,Dynamic score:p=0.7044,n=8）和雄性（PMWT:p=0.0952,Dynamic score:p=0.7991,n=8）小鼠的疼痛行为学亦无变化。4.待Cre依赖的h M4Di和对照病毒注射3周后,vlPAG脑区可见被mCherry标记的GABA能神经元,病毒表达成功。随后,选取CCI后第10天的雌性和雄性小鼠腹腔注射CNO,与mCherry对照组相比,h M4Di病毒组在第60 min和80 min的疼痛行为学得到明显地缓解,但差异无统计学意义。同样,选取CCI后第21天的雌性和雄性小鼠腹腔注射CNO后亦可缓解机械性痛觉超敏,但差异无统计学意义。结论:特异性敲除vlPAG内GABA能神经元CB1R后在雌性小鼠中产生更剧烈的痛觉超敏,并排除雌性和雄性小鼠GABA能神经元本身介导大麻素镇痛雌雄差异的可能性,从行为学方面证实vlPAG中CB1R表达的性别和细胞类型特异性有助于大麻素介导的镇痛雌雄差异效应。实验三vlPAG内GABA能神经元CB1R对GABA-v Glut2抑制性微环路突触传递影响的性别差异目的:前面两部分实验从行为学以及形态学等角度证实GABAvlPAG能神经元上CB1R的分布存在性别特异性,本部分实验应用转基因技术、脑片电生理结合光遗传和药理学方法旨在从突触水平探讨GABAvlPAG上CB1R的这种特异性分布是否通过改变突触传递可塑性来影响vlPAG内下行抑制系统的传出神经元的活性,最终形成CB1R被激活后所引起的大麻素镇痛效应的雌雄差异现象。方法:1.首先将v Glut2-Cre鼠与Ai9荧光报告基因小鼠杂交成功构建v Glut2-td Tomato荧光小鼠。2.制备v Glut2-td Tomato小鼠包含vlPAG的离体脑片,钳制v Glut2-td Tomato神经元并记录其接受的自发性抑制性突触后电流（spontaneous inhibitory postsynaptic currents,s IPSCs）在Control以及灌流CB1R激动剂ACEA时的变化。3.选取3-4周龄Gad2-Cre小鼠,在vlPAG脑区注射混合病毒r AAV-DIO-Ch R2-EGFP和AAV-Ca MKIIα-mCherry（1:1）。待病毒注射3周后,首先验证病毒表达成功,后制备表达有混合病毒的vlPAG离体脑片,钳制Ca MKIIα-mCherry神经元,记录光诱发抑制性突触后电流（opto-evoked inhibitory postsynaptic currents,o IPSC）和兴奋性突触后电流（opto-evoked excitatory postsynaptic currents,o EPSC）,并观察该反应在Control、ACEA以及洗脱阶段的变化。结果:1.成功构建v Glut2-td Tomato小鼠,并通过PCR方法对其基因型进行鉴定,并筛选出杂合子小鼠以备后续使用。2.钳制v Glut2-td Tomato神经元,在AMPAR（alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor）和NMDAR（N-methyl-D-asparate receptor）拮抗剂CNQX和AP5存在的情况下记录s IPSCs,灌流10μM ACEA前后,雌性小鼠中的v Glut2-td Tomato神经元记录到的s IPSCs频率降低74.08%（Control vs.ACEA,p=0.0003,n=6）,在雄性小鼠内降低42.98%（Control vs.ACEA,p=0.0187,n=6）,ACEA对s IPSCs频率的影响在雌雄小鼠中具有显著统计学差异（雌性vs.雄性,p=0.0147,n=6）。相反,应用CB1R激动剂ACEA并不影响v Glut2+神经元中记录到的s IPSCs振幅,在雌雄小鼠之间无统计学差异。并且,在将ACEA洗脱之后,应用GABAA受体拮抗剂Bicuculline即可阻断其大部分GABA能突触传递。3.在Gad2-Cre小鼠的vlPAG脑区注射混合病毒3周后,Ca MKIIα+投射神经元周围可观察到大量表达Ch R2（光敏感通道）-EGFP（绿色荧光蛋白）的GABA能神经元末梢,利用电生理结合光遗传方法特异性激活vlPAG内Ca MKIIα+投射神经元周围表达Ch R2的末梢,在v Glut2+神经元主要记录到o IPSC,在此基础上灌流ACEA,在雌性小鼠（Control vs.ACEA,p＜0.001,n=5）以及雄性小鼠中均可降低o IPSC幅度（Control vs.ACEA,p＜0.01,n=5）。并且,ACEA在雌性小鼠中将o IPSC幅度降低55.78%,在雄性小鼠中降低19.93%,两者具有显著的统计学差异（雌性vs.雄性,p＜0.001,n=5）。结论:vlPAG内GABA-v Glut2抑制性回路上CB1R激活使v Glut2+神经元接受到的GABA能前馈抑制功能降低,v Glut2+神经元相对更加兴奋,这种效应在雌性小鼠更明显,故vlPAG内GABA能神经元上CB1R表达的性别特异性确实在雌性小鼠上产生了更明显的突触前抑制作用,使vlPAG内的传出神经元更兴奋从而产生更强的镇痛作用。实验四Ca MKIIαmPFC-GABAvlPAG环路CB1R对vlPAG内GABA能神经元突触传递影响的性别差异目的:上述研究揭示了vlPAG内GABA能神经元轴突终末CB1R对GABA-v Glut2前馈抑制功能的影响,激活CB1R可在该突触中发挥短时程的抑制作用,从而使vlPAG内GABA能神经元相对被抑制,但是vlPAG内GABA神经元的兴奋性是否受其他脑区投射的影响将在本部分实验中进一步探讨。方法:1.首先在Gad2-Cre小鼠vlPAG脑区注射两种辅助病毒r AAV-Ef1α-DIO-EGFP-TVA和r AAV-Ef1α-DIO-RVG（1:1混合）,待病毒注射3周后再次注射伪狂犬病毒RV-ENVA-ΔG-Ds Red,1周后取材并制备冰冻切片,观察全脑的示踪情况。2.取mPFC脑片分别染GABA（小鼠源）或Ca MKIIα（小鼠源）+Neu N（豚鼠源）,观察其与逆向标记Ds Red神经元的共标情况。3.取mPFC脑片染Ca MKIIα（小鼠源）+CB1R（山羊源）,观察Ca MKIIα与CB1R的共标情况。4.在CB1R-flox小鼠mPFC脑区注射r AAV-Ca MKIIα-Cre-mCherry病毒特异性敲除Ca MKIIα神经元CB1R,待病毒注射3周后行CCI造模,并观察基础疼痛行为学以及CCI后第1,3,5,7,10,14和21天的疼痛行为学。5.在WT或CB1R-flox动物的vlPAG脑区和mPFC脑区分别同时注射r AAV2/R-h Syn-FLP-EGFP和r AAV2/9-h Syn-f DIO-Cre-mCherry病毒以标记或者特异性敲除投射到vlPAG脑区的Ca MKIIαmPFC神经元上的CB1R,待病毒注射3周后行CCI造模,并观察基础疼痛行为学以及CCI后第1,3,5,7,10,14和21天的疼痛行为学。6.首先在Gad2-td Tomato的mPFC区注射r AAV-Ca MKIIα-Ch R2-EYFP病毒,病毒注射3周后取2只动物经多聚甲醛灌注,切片验证病毒表达情况。确认病毒转染成功后制备表达有该病毒的包含mPFC以及vlPAG脑区的脑片,在mPFC内钳制Ca MKIIα-EYFP神经元并验证病毒可以正常发挥功能后,在vlPAG分别记录o EPSC和o IPSC。结果:1.在雌性小鼠以及雄性小鼠的多个脑区均能观察到Ds Red标记的逆行示踪神经元,如Ce M、mPFC、M1、M2等,雌雄无差异。2.GABAvlPAG逆向标记到mPFC内的神经元主要与Ca MKIIα存在共标,与GABA不存在共标,将RV-Ds Red与Ca MKIIα以及v Glut1三者共标,发现v Glut1亦表达于RV-Ds Red神经元上。3.特异性敲除mPFC内所有的Ca MKIIα神经元或者特异性投射到vlPAG脑区Ca MKIIα神经元上的CB1R后,疼痛行为学基础值无明显统计学差异,CCI造模后,在雌性和雄性小鼠中敲除组相对于对照组,均加重机械性痛觉超敏,并且存在性别差异。4.在mPFC内钳制Ca MKIIα-EYFP神经元,将膜电位钳制在静息膜电位水平,给予一个方波刺激后记录到的神经元可出现明显的动作电位,证明病毒表达能发挥正常的功能。在vlPAG脑区分别记录o EPSC和o IPSC,结果显示vlPAG内GABA神经元主要接受谷氨酸能兴奋性神经元的投射,即o EPSC,在此基础上灌流ACEA在雌性小鼠中可明显降低o EPSC幅度,但是在雄性小鼠中无明显作用,两者具有统计学差异（p＜0.05）。结论:GABAvlPAG逆向标记到mPFC内的神经元主要为Ca MKIIα+兴奋性神经元,而且该神经元轴突末梢广泛表达CB1R,这为mPFC到vlPAG内长投射的存在提供了结构基础。Ca MKIIαmPFC-GABAvlPAG长投射上CB1R被激活后可降低兴奋性突触反应,vlPAG内GABA神经元相对被抑制,和GABAvlPAG-v Glut2vlPAG抑制性突触形成协同效应共同促进大麻素镇痛效应的雌雄差异现象。本研究的结果表明,与雄性小鼠相比,激活或抑制vlPAG中CB1R在雌性小鼠分别产生更强的镇痛或致痛作用。特异性敲除vlPAG中GABA能神经元上的CB1R使雌性小鼠产生更剧烈的机械性痛觉超敏。vlPAG脑区内CB1R在GABA能神经元中的性别差异表达导致了行为学上的性别差异现象。此外,与雌性小鼠相比,雄鼠兴奋性（v Glut2+）神经元的GABA能输入对CB1R激动剂的敏感性较低。Ca MKIIαmPFC至GABAvlPAG长投射上的CB1R被激活后可降低兴奋性突触反应,vlPAG内GABA神经元相对被抑制,和GABAvlPAG-v Glut2vlPAG抑制性突触形成协同效应共同促进大麻素镇痛效应的雌雄差异。总之,上述结果揭示大麻素介导镇痛作用的性别差异,为更进一步探索雌性慢性疼痛治疗方法提供了结构和功能基础。