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贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)是我国传统中草药,味苦、辛,性平,可清热解毒,调经止血。我国民间常将其全草鲜品捣烂或干品研末敷患处,治创伤出血、痛疖肿毒和烧烫伤等。德国用它作抗抑郁症药已有100多年的历史。贯叶连翘提取物及其制剂与传统的化学抗抑郁药相比,具有疗效好、副作用小等特点。除此之外,贯叶连翘还具有抗抑郁、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗癌以及抗菌等作用。全球对贯叶连翘的需求量日益增加,使其成为目前世界上最畅销的三大中草药之一。由于世界范围内的大规模开发利用,贯叶连翘野生资源几近枯竭,已不能满足市场需求。提高贯叶连翘药材活性成分的含量、培育优质新品种已成为贯叶连翘资源开发中亟待解决的关键问题之一。为了更高效的开展育种工作,有必要了解贯叶连翘种质资源的遗传多样性。其次,对贯叶连翘活性成分合成和积累的关键因素及相关功能基因的研究,能够为育种及质量控制提供科学依据。鉴于此,本论文在已有研究的基础上,针对我国秦岭地区贯叶连翘资源,从形态、有效成分含量和DNA水平三个方面研究了贯叶连翘的遗传多样性,利用Illumina HiSeq 2000对不同生长时期的贯叶连翘进行了denovo转录组测序,将拟南芥AtPAP1转录因子转入贯叶连翘,获得了有效成分含量显著提高的贯叶连翘转基因株系,旨在为合理开发和研究贯叶连翘资源提供一定的研究基础。主要研究内容及结论如下:1.收集了秦岭地区贯叶连翘种质资源200余份,详细描述了他们的形态学特征。利用 SRAP(Sequence related amplified polymorphism,相关序列扩增多态性)标记技术研究了其中26个具有代表性的贯叶连翘种质之间的遗传多样性。SRAP分子标记选用12对引物组合,共得到183个条带,其中包含153个多态性条带,多态性比例83.6%。利用HPLC方法,测定了五个主要多酚类成分的含量。通过UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmetic means,非加权组平均法)对SRAP结果进行聚类,将样品聚为三个大支,相似系数0.57-0.97。具有相似性状的种质聚为一个大支,Cluster Ⅱ中的种质株高最高,芦丁含量较少,并含有较多的绿原酸、金丝桃苷和槲皮苷;Cluster Ⅲ中的种质株高最低,且茎上含有较少的黑色腺点;ClusterI中的四个种质茎上含有较多的黑色腺点。对形态学特征和有效成分含量进行了相关性分析,结果表明,茎侧面黑色腺点的密度(BDSS)与茎棱上黑色腺点的密度(BDVS)有极显著的相关性(P<0.001);茎侧面黑色腺点密度(BDSS)与叶片黑色腺点密度(LBD)呈显著正相关(P<0.05);另外,金丝桃苷含量与茎纵线棱上黑色腺点数目(BDVS)呈显著正相关,表明茎纵线棱上黑色腺点数目越多,叶片上黑色腺点数目越多,且金丝桃苷含量也越高。2.利用IlluminaHiSeq 2000对不同生长时期的贯叶连翘进行了denovo转录组测序,共得到 59,184 条 Unigene(GenBank 注册号:SRA050246.2),Unigene 的平均长度为422 bp。得到的转录组数据中有2,359条Unigene参与贯叶连翘的次生代谢途径,其中371条Unigene参与金丝桃素、贯叶金丝桃素、褪黑素和类黄酮的合成。运用PKSⅢexplorer鉴定出2,291条(3.87%)Unigene具有Ⅲ型聚酮合酶独特的氨基酸序列,可能为潜在的Ⅲ型聚酮合酶。与拟南芥转录因子数据库比对后,得到1,772条Unigene与拟南芥47个转录因子家族具有较高同源性。运用SSR位点分析软件MicroSAtellite对贯叶连翘转录组数据进行SSR位点分析,共获得7,643 个 SSR 位点,存在于 6,277 条 Unigene 中,1,130(18%)条 Unigene 中存在多个SSR位点。利用实时定量PCR对部分新获得的转录本在贯叶连翘不同器官的表达模式进行研究,褪黑素合成相关的基因的表达量在含叶绿体的器官中较高,与前人的研究结果相一致;PKS在花中表达量最高,符合聚酮化合物的含量在花期最高的研究结果。3.利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将外源转录因子AtPAP1转入贯叶连翘,获得了 19个AtPAP1基因稳定整合的贯叶连翘转基因株系。通过实时定量PCR检测,鉴定出4个AtPAP1基因高表达的贯叶连翘转基因株系用于后续实验。经HPLC测定,贯叶连翘转基因株系中芦丁、金丝桃苷和槲皮苷含量显著提高。AtPAP1表达量最高的PAP1-22中,芦丁、金丝桃苷和槲皮苷含量最高,分别为野生型含量的1.94、3.11和2.43倍,是转空载株系的1.91、2.97、1.99倍。PAP1-22总酚含量最高,为野生型的1.2倍。总黄酮含量在转基因株系中都有升高,与野生型有显著差异。PAP1-16总黄酮含量最高,为野生型株系的1.5倍。并采用实时荧光定量PCR方法对类黄酮生物合成途径上关键酶基因表达量进行检测,发现在转基因株系中HpPAL、HpC4H、Hp4CL和HpCHS的表达量均有不同程度的升高。PAP1-16中有6个基因的表达量显著升高,HpPAL、HpC4H、Hp4CH、HpCHS、HpF3’H和HpFLS,为对照的1.51-3.84倍。我们推测,PAP1-16中AtPAP1的表达,激活了途径上类黄酮合成相关的六个基因,使这六个基因表达量显著升高,从而使类黄酮大量合成和积累。