固定化乳杆菌转化菜油脚料生成共轭亚油酸的研究

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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid,CLA)是指一系列具有共轭双键的18个碳原子的不饱和脂肪酸的位置异构和几何异构的总称。它主要存在于反刍动物体内和乳制品中,其中最具有生理活性的异构体有c9,t11-C18:2和t10,c12-C18:2,而且这两种异构体是天然存在和人工合成中的主要异构体。CLA作为一种新发现的营养素,不仅具有抗癌作用、减肥降压功能,还具有抗糖尿病、提高免疫力等生理作用。目前大多数文献通常采用亚油酸,葵花籽油、红花籽油等价格昂贵的原料为底物转化生产CLA。菜油是我国主要食用油之一,产量占植物油总产量的1/3以上,其所产生的副产物——菜油脚料价廉易得,而且含有20%亚油酸,采用菜油脚料作为生成CLA的底物,不仅节约成本,还可以解决菜油脚料带来的环境污染问题。采用生物转化法得到CLA已然成为研究热点,其中固定化静息细胞转化生成CLA能达到细胞高密度,转化周期短,反应体系干扰物质少,不易染菌而且菌体可以重复利用,产物单一等优点,从而实现高效率、低成本、无污染生产的目的。本课题选用了嗜酸乳杆菌为生产菌,结合吸附固定化技术,利用嗜酸乳杆菌的静息细胞转化菜油脚料生成CLA,不仅降低生产CLA的成本,而且满足市场对CLA日益增长的需求,达到节约资源,减少菜油脚料对环境的污染,实现“变废为宝”的目的。本文首先采用不同方法提取菜油脚料里的中性油脂,通过油脂提取率以及油脂质量指标(酸价、皂化值、碘价)确定了最优的提取方法是直接离心法,其提油率为21.76%,酸价为24.2,皂化值为194.706,碘价为69.105,并且通过气相检测分析发现菜油脚料中所含不饱和脂肪酸达到90%,其中所含亚油酸为15.5%。然后对黑曲霉脂肪酶水解菜油脚料提取油脂(以下简称提取油脂)的工艺条件进行研究,经单因素试验,确定了黑曲霉脂肪酶最适添加量、底物浓度、酶解时间、酶解pH值、温度以及摇床转数,同时对酶的添加方式进行了对比分析。在此基础上,通过Design expert软件Box-Benhnken试验设计法对黑曲霉脂肪酶水解提取油脂的酶添加量,底物浓度,pH值,温度做了进一步优化研究,确定了最优酶添加量是240U/ml,底物浓度为75mg/ml,pH值是7.0,酶解温度40℃,采用直投酶粉的形式。在此优化条件下,提取油脂的水解率为26.92±0.86%,通过嗜酸乳杆菌转化提取油脂酶解液和未被水解的提取油脂生成CLA的对比分析,发现经脂肪酶水解处理的提取油脂乳化液被嗜酸乳杆菌转化后的CLA产量为127.65μg/ml,比未被水解的提取油脂产CLA量高2.95倍。随后以被脂肪酶水解的提取油脂为底物,在相同转化介质液体系和相同转化条件下,比较了植物乳杆菌(Lactibacillus plantarum)和嗜酸乳杆菌(Lactibacillus acidophilus)利用菜油脚料提取油脂酶解液生成CLA的能力,结果发现嗜酸乳杆菌产CLA总量为135.62μg/ml,是植物乳杆菌的1.3倍。论文最后对吸附固定化嗜酸乳杆菌静息细胞直接转化提取油脂酶解液生成CLA的条件进行了优化分析,通过单因素试验确定了最佳材料直径、最佳吸附时间、细胞浓度、转化温度、转化pH以及转化时间,同时研究了金属离子对嗜酸乳杆菌里亚油酸异构酶的影响,通过Box-Benhnken中心组合设计和响应面法对转化温度、转化pH和转化时间这三个重要的工艺参数作了进一步的优化分析,确定了最优转化条件是:转化温度39℃,转化pH6.5,转化时间20h,优化后的CLA产量可以达到226.25±0.73μg/ml。固定化嗜酸乳杆菌转化产CLA的产量是游离嗜酸乳杆菌的1.1倍。经固定化嗜酸乳杆菌颗粒可直接连续转化15个批次产CLA,其中前10个批次的CLA产量都在120μg/ml以上。
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