研究背景19世纪末期Erdheim教授首次在蝶鞍区域发现一类与胚胎发育时期咽鼓管相关的上皮型肿瘤。随后,1932年被誉为“神外之父”的Cushing教授将该肿瘤取名为“颅咽管瘤”,该名称到目前为止仍然还在使用。按照世界卫生组织（WHO）于2007年发表的中枢神经系统肿瘤在病理类型方面的划分,可将颅咽管瘤分为造釉细胞型（ACP）和鳞状乳头型两种类型,其中造釉细胞型占总体颅咽管瘤发病率的90%以上。造釉细胞型颅咽管瘤的起源部位来自于胚胎发育期间拉氏克囊的剩余上皮细胞,尽管WHO将其定义为Ⅰ级良性肿瘤,但是临床上的病例往往呈现恶性肿瘤的生物学表现。垂体功能低下在ACP中的发病率比其他鞍区肿瘤都要高,以生长激素低下（GHD）最为常见。垂体功能低下是指在一个或多个内分泌轴上有内分泌功能缺陷并伴有相关垂体病理表现。成人生长激素低下综合征已经得到了充分的定义,其特征是身体成分的改变、运动能力和生活质量（QoL）下降,以及心血管功能的一系列不利变化。既往研究认为垂体和相关供血血管被肿瘤压迫是GHD的主要发病原因。然而随后有学者发现内分泌水平与肿瘤大小并非绝对相关。因此,在ACP术前发生GHD的机制有待进一步研究。白介素-1α（IL-1α）由Gery教授于1972年首次发现。它是一种经典的促炎因子,分为前体形态和成熟体形态,两者均能够通过其受体IL-1R1促进炎症反应,尤其是在调理免疫反馈方面起着非常重要的作用。研究证实在慢性阻塞性肺疾病中,肺部成纤维细胞的激活和分泌细胞外基质（ECM）直接受到促炎因子的调控,并且阻断IL-1α的表达能够完全逆转肺部的纤维化。在本研究中,我们通过临床数据分析发现ACP分泌的IL-1α与GHD发病最具有相关性。我们推测ACP分泌的IL-1α通过促进脑垂体周细胞的活化而诱发垂体纤维化和GHD。因此,阐明ACP术前GHD的发病机制具有重要意义。此外,我们可以使用抗纤维化药物和抗炎药物改善GHD。研究内容与方法1.收集临床资料收集2017年9月至2018年1月在南方医科大学南方医院神经外科进行的颅咽管瘤全切除手术标本15例,所有标本都经南方医院病理科确诊为ACP。GHD的标本占10例,No-GHD的标本占5例,男性标本占8例,女性标本占7例。将每例手术标本分三部分使用,一部分进行常规的石蜡包埋,另外俩部分部分新鲜肿瘤组织经液氮保存和用于原代ACP细胞的培养,记录所有病人的临床资料,包括内分泌检查结果和影像学结果。2.改良大鼠生长激素细胞原代培养方法向南方医科大学南方医院实验动物中心购买200g±10g雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只。经异氟烷吸入麻醉后解剖大鼠腺垂体,将腺垂体组织随机分为两组。A组采用改进的办法(0.25%胰酶消化腺垂体,双次过滤弃去周细胞和无血清培养基培育生长激素（GH）细胞。B组采用传统办法（0.35%的胶原酶消化腺垂体,含胎牛血清的培养基培育生长激素细胞,更换培养皿以弃去周细胞）。统计A、B组1-6天的GH细胞数。ELISA实验比较GH的分泌情况。western blot检测周细胞在两种培养基中的激活水平,CCK-8、细胞划痕、细胞迁移等功能实验检测周细胞的细胞活力。3.体内外实验探索ACP分泌的IL-1α影响垂体生长激素分泌的潜在机制为诊断GHD,记录15例ACP患者胰岛素刺激试验后的胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、体重指数（BMI）以及生长激素峰值。对ACP标本进行组织学染色。采用Millipore bead arrays检测肿瘤组织和细胞上清中9种促炎细胞因子的水平。在体内和体外观察IL-1α对生长激素分泌的影响。采用Western blot、qRT-PCR和细胞功能检测等方法,探讨IL-1α抑制生长激素分泌的可能机制。采用立体定向ALZET渗透泵技术模拟大鼠ACP释放炎症因子的过程。将重组IL-1α（rrIL-1α）和ACP细胞上清制备的条件培养基（CM）在28天内,以1 ul/h的速度直接注入大鼠鞍内,测定IL-1α对垂体病理改变和生长激素分泌的影响。为了进一步证实IL-1R1受体是否在IL-1α影响生长激素分泌的过程中发挥潜在的作用,从第1天至第28天皮下注射IL-1R1阻滞剂（IL-1R1a,10mg/kg体重,日/1次）。4.统计学方法实验数据全部使用19.0版本的SPSS软件进行分析。组间比较运用独立样本t检验或单因素方差分析（ANOVA）。运用Spearman相关性分析指标间的相关性。P<0.05代表差异具有统计学意义。结果1.改良大鼠原代生长激素细胞培养方法随着时间的推移,改良法培养的原代大鼠生长激素细胞的存活率和生长激素分泌水平要明显高于传统方法培养出的生长激素细胞。同时,使用传统方法培养时,周细胞仅在培养3天后就开始迅速扩增,其激活指标α-SMA和CollagenⅠ和Ⅲ表达程度明显提高。2.体内外实验探索ACP分泌的IL-1α影响垂体生长激素分泌的潜在机制垂体纤维化与GHD呈正相关具有统计学意义（rS=0.756,P=0.001）。大量的细胞因子,尤其是IL-1α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、和白细胞介素-8（IL-8）在肿瘤组织和细胞上清中升高。GHD组与No-GHD组间只有IL-1α差异有统计学意义（肿瘤组织中P<0.001,F=6.251;细胞上清中P=0.003,F=1.529）。IL-1α显著降低了 GH3和周细胞共培养时生长激素的分泌。IL-1α介导的周细胞活化需要经过IL-1R1受体。在体内IL-1α诱导垂体纤维化,进而导致生长激素水平下降。这种病理性改变能够被IL-1R1a拮抗剂所抑制。结论改良后的原代大鼠生长激素细胞培育措施成功解决了周细胞污染的问题,同时延长了生长激素细胞体外原代培养的时间,其细胞的形状和活性较目前国内外文献中的培育方法有显著提高。该方法可被其它受非目的细胞污染的原代培养研究参考。我们提出,ACP细胞与垂体的间质细胞即周细胞之间的微环境作用是GHD形成的重要因素,IL-1α的下游信号可能是ACP术前GHD的潜在治疗方法。