论文部分内容阅读
锰过氧化物酶（MnP;EC1.11.1.13）是一种依赖H2O2的亚铁血红素糖蛋白酶,是一种常见的降解木质素的过氧化物酶,广泛存在于白腐菌中,目前国内对白腐菌MnP的研究多集中在酶学的基础研究上,对于白腐菌MnP的分子生物学研究还相对较少。由于MnP对木质素和多环芳烃等多种异生物质具有独特的胞外降解能力,因此这种酶在生物技术应用中极具吸引力,研究白腐菌MnP的基因结构和异源表达,为进一步深入研究MnP的降解机制与mnp基因表达调控之间的关系提供基础理论依据,对进一步构建优良工程菌株具有重要意义和理论价值。偏肿拟栓菌Pseudotrametes gibbosa是我国东北林区常见的一种多孔菌目多孔菌科的白腐真菌,在培养特性、产漆酶活性方面已有研究,但是对于该菌种另一种降解木质素的主要酶系锰过氧化物酶的研究尚属空白。本论文检测了偏肿拟栓菌分解木质素酶系统的产酶活性,对其MnP的cDNA基因进行了克隆和序列分析,并将该mnp基因转化毕赤酵母中实现了异源表达,主要研究结果如下:1.在4种不同的培养液中对偏肿拟栓菌和红平菇的木质素降解酶系统进行了锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶活性检测。结果在不含Mn2+的培养液中两种白腐菌均未检测到MnP的活性变化,但可检测到漆酶的活性变化;在含有Mn2+及添加了酶作用底物木屑和2,6-DMP的培养液中可同时检测到MnP和漆酶的活性变化;在4种不同的培养液中均未检测到木质素过氧化物酶的活性变化。表明偏肿拟栓菌和红平菇的木质素降解酶系统中可同时产生MnP和漆酶,而均不产生木质素过氧化物酶。2.对比4种培养液的酶活力测定结果,发现在培养液内添加酶作用底物木屑和2,6-DMP后可以显著提高MnP和漆酶的分泌量,表明底物对于白腐菌木质素降解酶系统的产生具有诱导作用;底物不同对于培养过程中酶活的高低影响也不同,添加木屑为底物要比添加2,6-DMP为底物的MnP和漆酶的产量稍高;在相同的培养方式中,偏肿拟栓菌比红平菇产生的酶活力稍高,偏肿拟栓菌MnP酶活力最高达165U/L,漆酶的最高酶活力为445U/L。3.采用简并PCR、RT-PCR、RACE方法从偏肿拟栓菌的成熟菌丝中克隆到了MnP的cDNA全长基因,命名为Pg-MnP。该基因含有1095 bp的完整开放阅读框（openreading frame,ORF）,起始密码子ATG,终止密码子TAA,编码364aa,5’非翻译区（5’UTR）有51个核苷酸,3’非翻译区（3’UTR）有160个核苷酸;Pg-MnP的cDNA全长基因与彩绒革盖菌Trametes versicolor的MnP基因同源性最高,序列相似性达到86%,与射脉菌Phlebia radiam、绵皮孔菌Spongipellis sp、拟蜡菌Ceriporiopsis sp、糙皮侧耳Pleurotus ostreatus的MnP基因序列相似性达到68%～80%,与T.versicolor的IiP基因同源性也较高,序列相似性达到67%。4.Pg-MnP基因序列中G+C含量占62.65%、A+T含量占37.35%;氨基酸组成中,Ala含量最高,达12.05%、其次为Gly和Thr,均达到8.22%,而Tyr含量为0.00%;预测蛋白分子量为38.24kD,pI为4.49,带负电荷残基（Asp+Glu）有45个,带正电荷残基（Arg+Lys）有20个,总原子数为5311个,分子式为C1690H2619N455O536S11,不稳定指数为49.13,属不稳定蛋白,脂肪族指数为80.22,总平均疏水性为0.010;5.Pg-MnP蛋白信号肽最可能的剪切位点在21～22aa之间,为ANG-AA;该蛋白序列在30～50aa、129～147aa间存有两个疏水区域,跨膜区预测位置也在30～50aa、129～147aa间,这与亲/疏水性预测结果一致;Pg-MnP蛋白的二级结构中主要以无规则卷曲和a螺旋为主,二者在氨基酸中的比例达51.92%和36.81%,间或有β折叠结构;对该蛋白进行亚细胞定位,发现Pg-MnP的蛋白主要位于胞外、过氧化物酶体、内质网隔膜及内质网管腔;用SWISS-MODEL在线三维结构比对预测,用Chimera输出了MnP的三维模型,用Cn3D进行功能位点模拟,预测了Fe血红素,Ca原子、Mn结合位点及组氨酸残基位置。6.采用RT-PCR方法克隆得到用于酵母表达的pg-MnP完整CDS基因片段,将Pg-MnP目的基因片段与pPICZB载体质粒双酶切,构建重组质粒pPICZB/MnP;通过电转化的方法,将pPICZB/MnP重组质粒整合到毕赤酵母中进行MnP的异源表达,PCR验证结果表明,重组质粒pPICZB/MnP已被成功转化到毕赤酵母中;将重组MnP进行诱导表达,在96h内酵母的生物量随着培养时间的延长而不断增加,诱导表达的酵母培养上清液中MnP酶活72h达到最高,最大酶活力7U/L,在添加了heme的培养基中未检测到MnP的活性变化。