研究背景:乳腺癌是当代女性最常见的癌症,威胁着全球女性的健康。我国乳腺癌的发病和死亡趋势不可轻视。根据我国女性乳腺癌流行病学特征,1994～2013年女性乳腺癌死亡率逐年上升;近10年我国女性乳腺癌标化死亡率高于前10年,且上升速度较前10年更快;同时城市高于农村,且增长较快。更多的研究还显示出从30岁开始,我国女性乳腺癌死亡率增长较快,可见我国女性乳腺癌越来越年轻化[1-3]。因此,有关乳腺癌发生发展的相关分子机制越来越引起临床医学界的重视。通过研究乳腺癌发生发展的相关机制,以期找到预防和治疗乳腺癌的最佳方案,提高我国女性的健康水平。近年来随着医学分子学领域的技术进步促进了对乳腺癌基因组的认识,同时也推动了乳腺癌分子分型的发展。乳腺癌分子分型主要有Luminal A、Luminal B、HER-2过表达和Basal-like型4个主要的分子亚型[4,5]。不同的基因表达模式反映了乳腺癌肿瘤细胞生物学的基本差异,更重要的是与临床结局显著相关,因此乳腺癌的内在分型得到广泛的认可和应用。并在过去十几年中极大地改变了对乳腺癌基础与临床的认识,其在流行病学领域的应用也对传统乳腺癌危险因素的认识和研究模式有所影响。传统乳腺癌流行病学研究认为生育因素、体型/肥胖、吸烟饮酒、运动、外源激素、电离辐射以及饮食等者与本病发生相关。然而不同亚型乳腺癌的危险因素则存在较大差异[6]。且乳腺癌预后主要受患者的临床病理特征影响,组织学分级、病理类型、分期等都依据不同基因表达,是本病预后的重要指标。但因国内尚缺少成熟的乳腺癌病例队列,对中国人群乳腺癌预后因素研究尚不足[7]。作为一种多功能激酶,糖原合成激酶-3（glycogen synthesis kinase,GSK-3）参与多种细胞的反应。在动物体内存在GSK-3α和GSK-3β两种亚型。其中GSK-3β作为一个多功能激酶,不仅参与机体糖原代谢,更在蛋白质合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动以及肿瘤发生等方面都起着重要的作用。关于GSK-3β在肿瘤中的作用根据不同的肿瘤类型其发挥的作用和具体的分子机制亦不尽相同。如发现其在结肠癌、肝癌、胰腺癌中均是高表达,在胰腺癌中抑制其表达可以抑制肿瘤的生长和血管生成[14-17]。这提示了此酶有促进肿瘤生长的作用。而在另一些报道中GSK-3β可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制肿瘤的进展[18-22]。而失活型GSK-3β可以导致乳腺癌细胞系MCF-7的耐药[20]。Marganit farrago[25]等通过基因修饰的方式抑制乳腺癌细胞系中GSK-3β的活性,发现Wnt通路异常激活,β-catenin在肿瘤细胞核中聚集增加,cyclin D1表达增加,肿瘤细胞增殖加快,凋亡减少。上述研究提示GSK-3β参与了乳腺癌细胞生长和细胞凋亡信号通路调控。但是否参与乳腺癌细胞的迁移和自噬,及相关分子生物学机制仍有待于进一步研究。而通常细胞自噬是在刺激ULK Ⅰ/Ⅱ（Unc-51样激酶1/2,Unc-51-like kinase 1/2）复合物后触发的,该复合物调节哺乳动物自身吞噬体的生成。而Amp-激活蛋白激酶（AMPK）是细胞主要的能量传感器。当机体组织处于营养或代谢应激条件下,包括缺血时,细胞中AMP的浓度降低和ATP的浓度增高,将会激活AMPK。Hadad等[8]研究发现,乳腺癌中AMPK的低表达与其组织学分级和淋巴结转移密切相关,此发现进一步支持AMPK成为乳腺癌潜在的治疗靶点。另有学者[11]研究表明,应用二甲双胍激活AMPK后,可抑制m TOR信号级联通路,进而抑制乳腺癌细胞的增生;进一步研究表明,当用RNA干扰技术沉默AMPK表达后,可以减弱二甲双胍对乳腺癌细胞的抑制作用。研究中可发现,有关AMPK的活化已被广泛研究,而抑制AMPK的机制仍不十分明确[9-13]。Suzuki研究[23]认为GSK-3可以通过β亚基与AMPK相互作用形成稳定的复合物而抑制AMPK的功能,如果扰乱GSK-3与AMPK复合物的功能,将提高AMPK的活性和提高细胞的分解代谢（甚至包括在细胞的合成代谢过程中）,表明通过GSK-3路径抑制AMPK活性是细胞进入合成代谢状态的关键。另有[24]研究认为AMPK/GSK-3β/β-catenin通路引发CEMIP（Cell migration induced hyaluronan-binding protein,细胞迁移诱导透明质酸结合蛋白）超表达以促进前列腺癌的迁移和侵袭。但既往研究中对GSK-3β与AMPK通路在乳腺癌的发生发展中的作用机制研究尚不充分。研究目的:第一部分:该部分为临床研究部分,主要应用免疫组织化学方法检测GSK-3β在乳腺癌细胞中和癌旁组织中的的表达,并通过临床患者生存数据的搜集,利用统计分析两者相关性。通过这一部分的研究来观察乳腺癌细胞中GSK-3β的表达情况与癌旁组织中GSK-3β的表达情况的差别是否有统计学意义;另外,观察和统计不同程度表达GSK-3β的乳腺癌患者的总生存期有否差异。通过上述研究以提示GSK-3β是否有预测乳癌病人临床预后的潜力。第二部分:实验研究。主要采用qRT-PCR和western blot（WB）方法检测其在乳腺癌细胞T47D中的表达;在T47D细胞中,利用shRNA质粒载体实现GSK-3β基因敲除。探索其所涉及的生物反应和信号通路下游途径。探讨GSK-3β基因敲除是否可以抑制乳腺癌细胞的进展。另外,通过抑制GSK-3β的表达,观察T47D细胞中ATP生成情况和AMPK的表达情况是否有相关性;因以往研究证实细胞内AMPK激活的同时可增加LC-3II的生成,而LC-3II的生成增加是吞噬细胞激活的典型标志,可促使细胞加强自噬。以上作用在肿瘤细胞中表现为抑制成瘤。因此,我们研究GSK-3β是否参与乳腺肿瘤细胞T47D的AMPK下游途径的调控和通过介导AMPK通路的激活来加强肿瘤的自噬作用。通过上述观察,预测GSK-3β是否有希望作为乳腺癌临床治疗和预后的靶点。材料与方法:第一部分:临床研究选取病例:本课题的临床标本来自广西中医药大学第一附属医院手术切除乳腺癌标本。收集64例乳癌及其对应癌旁（>5cm）正常乳腺组织。其中部分置于-80℃冰箱保存留用,剩余做石蜡切片。对64例人乳腺癌组织和配对的非恶性组织进行了GSK-3β翻译的检测。1.免疫组织化学（IHC）和组织微阵列（TMAs）TMAs由上海生物芯片有限公司Co.Ltd提供,组织病理学诊断符合世卫组织标准。总生存期（OS）指乳腺癌患者手术至死亡的时间,死亡患者的数据在死亡当天进行收集整理,而其余患者的数据在随访结束时进行收集整理。石蜡切片行IHC免疫组化检测,切片厚度为4微米。H&E染色证实恶性,切片在4°C下进行过夜孵育,抗原提取后与原抗体共同孵育。在37?°C与HRP结合的二抗孵育30 min,用二氨基联苯胺显影。2.免疫组织化学变量的评估GSK-3β蛋白在乳腺癌细胞的细胞质和细胞核中均有表达,染色呈棕黄色颗粒,以阳性细胞数量为基础,用四点评分法（0-4）检测GSK-3β的表达,阳性细胞比例分为<5%（0）、5-25%（1）、25-50%（2）、50-75%（3）或>75%（4）,染色强度分为:不染色（0）、浅棕（1）、棕色（2）和暗染色（3）。选择阈值评分为5分,将高表达患者与低表达患者区分开来。高表达或低表达的患者分别为GSK-3β高组或GSK-3β低组。第二部分:实验研究细胞系选取:人类乳腺癌细胞（T47D）购自ATCC（Maasas,VA,美国）。细胞培养基:T47D细胞在培养基（Gibco,Gaithersburg,MD,USA）中进行培养,培养基内含:10%经热灭活的新生牛血清、100μg/m L链霉素和100单位/ml青霉素（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）.1.转导和克隆选择我们从圣克鲁斯生物技术的p LKO.1-puro中获得了针对GSK-3β的shRNA,建立了稳定的敲除克隆,应用GSK-3β的免疫印迹技术对获得稳定转导的克隆进行了验证。2.穿膜（Transwell）实验我们将约1×105细胞悬浮于无血清的200μl（微升）培养液中,加入透孔（24孔板,8 mmol）,24孔板加满培养液（600μl）,24h后用福尔马林固定,用0.1%结晶紫染色。3.体外增殖和菌落生成实验将细胞接种在96孔板上,密度水平:每孔500个细胞,进行隔夜培养,然后加入细胞计数盒-8（CCK-8,Promega,Madison,WI,USA）,在37?°C下孵育2小时。用吸收值为450 nm微板分光度计（Bio Tek,Winooski,VT,USA）对细胞进行定量。持续观察细胞5天并绘制细胞生长曲线。用三聚氰胺进行细胞生长试验,为探讨细胞在较长时间内的作用,将细胞接种于完全培养基的6孔板中,接种密度为1,000个细胞/孔,37?°C孵育14天,用0.1%结晶紫染色。4.实时荧光定量PCR（RT-PCR）用TRIzol反应物提取总RNA,用逆转录（RT）方法获得c DNA（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）,以β-肌动蛋白（β-Actin）为内参照,用ABI棱镜7900 HT系统对转录进行定量。根据Ct值对逆转录进行评价,比较Ct法将其归一化为β-Actin。5.Western blot检测本检测是按相关文献[16,17]描述进行的,实验选用的抗体为GSK-3β,β-Actin（Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX,USA）,和N-cadherin,E-cadherin,Vimentin,ATG 5,LC-3Ⅰ/Ⅱ,p-AMPK或AMPK（Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA）。检测自噬标记物ATG 5和LC-3Ⅰ/Ⅱ在含和不含GSK-3β-KD的T47D细胞中的表达。6.ATP依赖性荧光素酶检测、AMP/ATP应用HPLC检测和糖酵解试验用Perkin Elmer（Waltham,MA,USA）公司的ATPLite?检测试剂盒测定细胞中ATP的浓度。利用细胞分析试剂盒对细胞糖酵解产生的最终产物L-乳酸进行定量,获得培养基,为检测糖酵解功能做准备。在采用高效液相色谱法（HPLC）之前,细胞被洗涤并重新悬浮在PBS中。用0.05 M KOH溶液快速裂解细胞,将其调至pH值6,进行反相色谱层析,分离出ATP和AMP。流动相（PH 6）为0.1 M KH2PO4,0.008 M四丁基硫酸氢铵,乙腈（含溶剂B 30%,溶剂A 2%）。使用授权软件II（Waters,Milford,MA,USA）进行分析和仪器控制。统计分析:应用SPSS19.0（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）统计软件进行数据处理:采用t检验分析Western Blot图像灰度值、Transwell穿膜细胞数,用LSD-t检验对各样本均数行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果:第一部分:临床研究对64例人乳腺癌组织和癌旁的非恶性组织进行了GSK-3β表达的检测。研究表明,在上述乳腺癌组织和对应的癌旁组织标本中,GSK-3β蛋白在乳腺癌组织中的表达与周围正常组织相比表现出较高的IHC评分。通过对相应病例的随访,统计发现GSK-3β表达增加与乳腺癌病人总生存期（overall survival,OS）缩短有相关性。此外,GSK-3β低水平患者的生存率明显高于GSK-3β高水平患者。第二部分:实验研究1.GSK-3β-KD抑制乳腺癌进展为了研究GSK-3β活性对细胞的影响。我们用shRNA生成GSK-3β-KD（敲除GSK-3β）乳腺癌细胞。实验中GSK-3βshRNA的补充使T47D乳腺癌细胞中的GSK-3β的翻译和转录明显下降。初步研究了GSK-3β表达下调对T47D乳腺癌细胞增殖的影响。增殖实验显示,补充GSK-3βshRNA后,T47D乳腺癌细胞的增殖受到抑制。同时,菌落发生试验显示,与T47D/sh GSK-3β组相比,T47D-NC克隆数量更多。还发现T47D/sh GSK-3β组的克隆生成量与对照组相比受到抑制。这些结果表明,GSK-3β-KD可以抑制乳腺癌细胞T47D的增殖,亦即表明GSK-3β可能促进乳腺癌细胞T47D的增殖。此外,体外迁移试验表明,T47D-NC的迁移细胞数量明显高于T47D-sh GSK-3β（图3A）。现代研究普遍认为上皮间充质转化（EMT）在恶性肿瘤进展和转移过程扮演重要角色。主要是指肿瘤从极化的上皮癌细胞向运动和收缩的间充质细胞的转变,其主要的特征有细胞黏附分子（如E-钙黏蛋白,E-cadherin）表达的减少、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）表达增加、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。其中,E-cadherin可维持细胞间紧密连接,阻止细胞活动侵袭及转移扩散。通过EMT,上皮细胞失去了细胞极性,失去与基底膜的连接等上皮表型,获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[105]。因此我们旨在研究GSK-3β对乳腺癌细胞上皮间充质细胞生长发育的影响。采用Westernblot和qRT-PCR技术,检测与EMT相关的典型生物标志物在T47D细胞中的表达。补充GSK-3βshRNA后,E-cadherin的表达明显增强。然而,间充质生物标记物N-cadherin和波形蛋白的表达受到明显抑制。2.GSK-3β-KD有促进乳腺癌自噬的作用采用Western blot方法,检测自噬标记ATG 5和LC3Ⅰ/Ⅱ在含和不含GSK-3β-KD的T47D细胞中的表达。结果显示:GSK-3β-KD促进自噬标志物ATG 5和LC3Ⅰ/Ⅱ转换。表明GSK-3β-KD有促进乳腺癌自噬的作用。作为对比,在使用自噬抑制剂（3-MA,200μmol）24小时后可明显抑制GSK-3β-KD引起的ATG5和LC3 Ⅰ/Ⅱ转换的过度表达。以上结果表明GSK-3β有抑制乳腺癌T47D细胞自噬的作用。3.抑制GSK-3β可降低ATP生成由于细胞的能量危机可促使细胞自噬的激活,我们接下来将检测GSK-3β抑制是否影响细胞内ATP的浓度。T47D细胞饥饿血清培养24小时后加入GSK-3β抑制剂。根据ATP依赖的荧光素酶测定,ATP浓度随着血清剥夺时间的延长而适度降低。而在用GSK-3β抑制剂TWS 119处理后可显著降低ATP浓度。提示血清饥饿后抑制GSK-3β可减少细胞ATP的生成,从而激活细胞的自噬以促进细胞自噬。4.抑制GSK-3β促进AMPK激活作为能量的主要传感器,AMPK在能源危机后将立即受到刺激激活。在细胞血清饥饿培养后,当抑制GSK-3β减少ATP生成时,检测AMPK是否与抑制GSK-3β作用平行激活。我们用TWS 119（GSK-3β抑制剂）补充剂通过评估AMPK的磷酸化程度来研究AMPK的激活。补充TWS 119试剂4小时后,AMPK pT 172浓度明显高于空白溶剂补充剂对照组。这与当使用特定的siRNA实现GSK-3β基因敲除时,结果相似。提示LC-3II的产生是通过血清剥夺引起的,并在GSK-3β抑制后得到促进,与AMPK的激活同时出现。结论:综上所述,我们的结果表明敲除GSK-3β基因能够抑制乳腺癌细胞的体外增殖和迁移。它还可以增强AMPK通路介导的自噬作用。亦即,GSK-3β可以促进乳腺癌细胞的体外增殖和迁移,并抑制肿瘤细胞自噬。根据上述结论,本研究揭示了GSK-3β对乳腺癌发展的影响,推测GSK-3β的表达可作为乳腺癌患者治疗性手术临床结局的新预测因子,另外也提示GSK-3β可能是治疗乳腺癌的一个有前途的靶点。