本研究采用细胞培养、RNA干扰、GFP-LC3/m Cherry-GFP-LC3荧光标记、MDC染色、TUNEL和/或DAPI染色、细胞活性检测和Western blot分析等细胞生物学和分子生物学技术和方法,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,通过建立的镉暴露细胞模型,较为系统地研究了二甲双胍改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡分子机理。结果如下:1二甲双胍干预镉诱导神经细胞自噬体积累抗凋亡研究以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,用不同浓度的二甲双胍(0-1.5m M)预处理24 h后暴露镉(10μM)4 h、12 h或24 h。采用Western blot分析Atg5、LC3、p62、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP蛋白表达,细胞感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体,MDC染色自噬体荧光强度,MTS实验和TUNEL/DAPI染色评估细胞活性和凋亡。结果显示,二甲双胍抵抗镉诱导的神经细胞活性下降和凋亡,抑制镉引起的细胞Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Atg5、LC3-II和p62表达增加,削弱镉诱导的细胞自噬体积累。提示:二甲双胍干预镉诱导神经细胞自噬体积累抗凋亡。2二甲双胍通过调控Atg5和自噬流改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡机理研究以PC12细胞和小鼠原代神经元、或用慢病毒sh RNA Atg5或sh RNA GFP感染的PC12细胞为实验对象,用二甲双胍(1 m M)预处理24 h和/或氯喹(CQ)(25μM)预处理1 h后暴露镉(10μM)4 h、12 h或24 h。采用Western blot分析Atg5、LC3、p62和Cleaved-caspase-3蛋白表达,细胞感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体,TUNEL染色评估细胞凋亡。结果显示,下调Atg5显著强化二甲双胍抑制基础的和镉诱导的神经细胞LC3-II和Cleaved-caspase-3表达,提高二甲双胍改善镉诱导的神经细胞自噬体积累和凋亡;由CQ损伤自噬流加强镉诱导神经细胞LC-II、p62和Cleaved-caspase-3表达以及自噬体积累和凋亡,且抵抗二甲双胍对镉诱导细胞这些事件的抑制作用。提示:二甲双胍通过调控Atg5和自噬流改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡。3二甲双胍通过激活AMPK阻滞自噬流损伤改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡机理研究以PC12细胞和小鼠原代神经元、或用腺病毒Ad-AMPK-ca或Ad-Lac Z感染的PC12细胞为实验对象,用二甲双胍(0-1.5 m M或1 m M)预处理24 h和/或AICAR(2 m M)预处理1 h后暴露镉(10μM)4 h、12 h或24 h。采用Western blot分析AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、Atg5、LC3、p62和Cleaved-caspase-3蛋白表达,细胞感染Ad-GFP-LC3荧光标记自噬体、感染Ad-m Cherry-GFP-LC3双荧光标记分析自噬流表现,TUNEL染色评估细胞凋亡。结果显示,二甲双胍激活AMPK,并抵抗镉诱导的神经细胞AMPK失活;由AICAR激活AMPK或AMPK持续激活(AMPK-ca)表达强化二甲双胍抑制镉诱导神经细胞Atg5、LC3-II、p62和Cleaved-caspase-3表达,增强二甲双胍改善镉诱导神经细胞自噬体积累和凋亡;AMPK-ca表达强化二甲双胍抵抗镉诱导的神经细胞自噬流损伤。提示:二甲双胍通过激活AMPK阻滞自噬流损伤改善镉诱导神经细胞自噬体积累依赖的凋亡。