第一部分特发性无精子症患者皮肤成纤维细胞分离与培养目的建立一种标准化的且可重复操作的人皮肤成纤维细胞分离培养方法,并从形态学,免疫组织化学及细胞增殖能力等方面对培养的真皮成纤维细胞进行鉴定。方法1.特发性无精子症患者的皮肤标本取自显微取精手术切口,正常对照的皮肤标本来自行包皮环切手术的生育力正常男性。相关手术操作由专业泌尿外科医生在无菌条件下进行。所有临床标本收集均告知患者用于科学研究并签署知情同意书。2.组织块贴壁法分离皮肤成纤维细胞及原代培养。3.成纤维细胞形态学分析,免疫荧光染色检测标记物VIMENTIN的表达。4.流式细胞分析检测免疫表型。5.细胞生长曲线绘制。6.MTT检测细胞增殖能力。结果1.在原代细胞培养过程中,成纤维细胞具有典型的形态特征,表达III型中间丝蛋白家族成员VIMENTIN。2.生长动力学分析表明成纤维细胞增殖能力强,活性较好,冻存过程对其形态和生长特征无明显影响。3.流式分析结果表明第3代成纤维细胞普遍表达表面分子CD73,CD90,CD44,CD105(阳性比例分别为98.5%,100%,99.8%及98.1%),几乎不表达CD45与CD34(阳性比例均为0.4%),提示细胞纯度高。结论采用皮肤组织块贴壁法可成功分离得到高纯度的真皮成纤维细胞。在原代细胞培养过程中,成纤维细胞具有典型的形态特征,增殖能力强,免疫组织学分析提示细胞纯度高,冻存过程亦对其生长特征无明显影响,能够满足后续实验所需。第二部分特发性无精子症患者诱导多能干细胞构建及鉴定目的利用重编程技术构建特发性无精子症患者的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),并对其多能性进行鉴定,使之更有效地应用于后续的分化研究。方法1.分离培养特发性无精子症患者的真皮成纤维细胞,然后用携带OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC四个重编程转录因子的逆转录病毒感染皮肤成纤维细胞,促使其重编程为iPSCs。2.免疫组织化学检测iPSCs多能性标记物NANOG,SOX2,OCT4,TRA-1-60及SSEA-4的表达。3.免疫组织化学检测iPSCs碱性磷酸酶(AP)的表达。4.RT-PCR检测iPSCs多能基因OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC,NANOG及LIN28的相对表达水平。5.流式细胞分析检测iPSCs多能基因OCT4,SOX2及NANOG蛋白水平表达。6.核型分析。结果1.我们共构建两例特发性非梗阻性无精子患者的iPSCs,分别命名为iPSC1106和iPSC1122,同时我们也构建了一例正常男性的iPSCs。2.所有获得的iPS细胞系均阳性表达多能性表面抗原SSEA-4,TRA-1-60及核转录因子OCT4,NANOG,SOX2。3.特发性男性不育患者及正常男性iPSCs均表达多能性相关基因OCT4,SOX2,KLF4,C-MYC,LIN28,NANOG,REX,TDGF及HTERT,且AP阳性。4.我们通过畸胎瘤及拟胚体形成实验分别证实了所得iPSCs具有体内及体外向三胚层分化的能力。5.所得iPSCs均具有正常核型,重编程过程并未影响染色体稳定性。结论特发性无精子症患者iPSCs在形态学,多能基因表达水平及三胚层分化能力上与正常男性来源的iPSCs及人胚胎干细胞(embryonic stem cells,h ESCs)无明显区别。核型分析结果提示,重编程过程并未引起核型异常,为后续的分化研究奠定了基础。第三部分特发性无精子症患者诱导多能干细胞向原始生殖细胞诱导分化目的探索特发性无精子症患者的iPSCs体外向原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分化的能力,并将其异种移植入小鼠的生精小管,观察其体内的分化能力。方法1.特发性无精子症患者及正常男性iPSCs,h ESCs体外向PGCs诱导分化,主要通过两步诱导法,包括类中胚层阶段诱导及PGC阶段诱导。2.RT-PCR及免疫荧光染色检测特发性无精子症患者iPSCs体外分化过程中PGC特异性基因表达变化。3.RT-PCR及免疫荧光染色检测特发性无精子症患者iPSCs体外分化过程中多能性相关基因的表达变化。4.RT-PCR检测特发性无精子症患者iPSCs体外分化过程中三胚层基因的表达变化。5.流式细胞分析检测特发性无精子症患者iPSCs体外分化效率,主要采用Ep CAM/INTEGRINα6以及c-KIT/INTEGRINα6双阳性细胞的比例做为评价指标。6.特发性无精子症患者iPSCs异种移植至无精子症模型小鼠生精小管并观察其分化情况。结果1.经过两天的预诱导过程,贴壁培养的iPSCs呈现扁平上皮细胞形态,且细胞边界清晰。进入悬浮诱导培养阶段,细胞形成拟胚体球。2.PGC诱导第4天,四个细胞系形成的拟胚体均表达PGC早期特化相关的基因TFAP2C,BLIMP1,PRDM14,OCT4和NANOS3,仍低表达甚至不表达DPPA3及晚期PGC相关基因DDX4及DAZL。3.除iPSC1122外,其他三个细胞系在预诱导后均明显下调了PRDM14基因的表达。PGC诱导第4天,四个细胞系形成的拟胚体均表达相似水平的多能性相关基因OCT4和NANOG,但是SOX2基因表达明显抑制。与未分化的多能细胞相比,PGC诱导后的拟胚体表达较高水平的内细胞团相关基因ZFP42,KLF4及TFCP2L1。4.PGC诱导第4天,四个细胞系形成的拟胚体明显下调内胚层基因GATA6,中胚层基因RUNX2和EOMES,及外胚层基因PAX6的表达,上调内胚层基因SOX17的表达,且SOX17阳性的细胞均不表达多能性基因SOX2。特发性无精子症患者iPSCs(1106和1122)经过预诱导后所得的类中胚层样细胞(incipient mesoderm-like cells,i Me LCs)相比于正常iPSCs及ESCs来源的i Me LCs,中胚层基因EOMES的表达相对较低,而且iPSC1106经PGC诱导分化后所得的拟胚体SOX17基因的表达也明显较低。5.不同来源的iPSCs分化所得的拟胚体中Ep CAM/INTEGRINα6双阳性细胞比例相似,然而,病人来源的iPSCs分化所得的c-KIT/INTEGRINα6双阳性细胞比例相对较低。6.异种移植体内实验表明,不同来源的iPSCs均具有定植于小鼠生精小管基底膜的趋势,且明显表达生殖细胞特异基因DDX4,但是无精子症患者iPSCs增殖能力相对有限,且DDX4阳性细胞比例相对较低。结论通过体外模拟人类生殖细胞早期发育的信号调控及分子环境(ACTA,CHIR,BMP4,LIF,SCF,EGF等因子的一系列作用),特发性无精子症患者iPSCs具有体外向原始生殖细胞样细胞(PGC-like cells,PGCLCs)分化的能力,但是与正常iPSCs及ESCs相比,特发性无精子症患者iPSCs在体外向PGCLCs诱导分化过程中三胚层基因的表达情况,诱导效率及体内分化潜力存在一定的差异,这些差异可能与无精子症发生的遗传或表观遗传背景相关。第四部分原始生殖细胞样细胞全转录组测序分析及比对目的对特发性无精子症患者iPSCs及其体外分化所得i Me LCs和PGCLCs进行高通量全转录组测序分析,并与正常iPSCs及ESCs来源的PGCLCs和已发表的人性腺PGCs转录组数据进行比对分析,为进一步的研究及临床应用奠定基础。方法1.流式分选PGC诱导第4天拟胚体中Ep CAM/INTEGRINα6双阳性的PGCLCs。2.对各细胞样本进行RNA-seq分析(iPSCs/ESCs,i Me LCs及PGCLCs)。3.测序数据生物信息学分析。4.PGC体外诱导过程中全转录组与人类性腺PGC全转录组比对分析。5.免疫荧光染色检测PGC诱导第4天拟胚体中表观遗传相关分子的表达。结果1.我们一共完成24个样品的转录组测序分析,共获得127.11Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到4.54Gb,Q30碱基百分比在74.59%及以上。分别将各样品的Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对,比对效率从62.28%到94.72%不等。2.不同细胞系在PGC诱导的不同阶段均有明显的基因表达谱变化,我们将差异表达基因进行层次聚类分析,病人特异性iPSCs的聚类模式与正常iPSCs明显不同。3.对四个细胞系共同上调和下调的基因进行GO富集分析发现,由iPSCs或ESCs向i Me LCs预诱导过程中,上调基因富集于BMP信号通路,WNT信号通路,细胞迁移调控及男性性腺发育调控等GO分类,而下调基因富集于细胞黏附,神经系统分化,细胞分化及胚胎发育调控等GO分类。由i Me LCs向PGCLCs诱导分化过程中,上调基因富集于细胞迁移调控,细胞增殖调控,男性性腺发育及细胞外基质合成等GO分类,而下调基因富集于神经发育等GO分类。4.特发性无精子症患者iPSCs体外分化过程中的基因表达与小鼠PGC的特化既存在相似之处,也存在明显差异。5.特发性无精子症患者iPSCs与正常iPSCs及ESCs呈现一致的染色结果,在诱导第4天,大部分TFAP2C阳性的细胞不表达5m C,而表达5hm C,提示去甲基化趋势,且TFAP2C阳性的细胞均表达TET1。特发性无精子症病人iPSCs分化第4天,OCT4阳性的细胞仍持续表达DNMT3A,而对于正常iPSCs和ESCs,在PGC特化的第4天,OCT4阳性的PGCLCs大部分不表达DNMT3A。6.通过与人性腺PGC转录组进行比对,体外诱导PGC特化与体内PGC特化过程中部分基因的表达动态相似,但是仍有大量的基因表达谱差异明显。结论从基因表达谱分析,特发性无精子症患者iPSCs经过i Me LCs阶段诱导可以体外分化为处于早期阶段的PGCLCs,但特发性无精子症患者iPSCs在体外PGC诱导过程中某些关键基因的表达水平相对较低,而且体外PGC特化仍不能完全模拟体内PGC的发育过程,这些都可能与早期生殖细胞发育的遗传缺陷相关,仍需进行深入研究。同时,特发性无精子症患者iPSCs与对照iPSCs和ESCs相似,均在体外PGC诱导的过程中一定程度起始了DNA去甲基化等全基因组表观遗传变化。