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研究背景:子宫腺肌病(Adenomyosis,AM)是一类妇科常见疾病,具体发病机制不明确,治疗上没有保守的根治药物。近年来,AM的发病年龄不断下降及女性对于保留生育功能的需求,都值得继续研究该病机制从而探寻更好的治疗方法。目前认为AM的发病中子宫内膜细胞向子宫肌层的迁徙是致病关键,和子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)相似,两者都是子宫内膜异位至其他部位导致疾病的发生,这其中涉及到子宫内膜细胞的迁徙。水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是一类参与水分子转运的糖蛋白,研究发现其在细胞迁徙过程中起着重要的作用。有研究发现AQPs在EMs的发病中发挥作用,水通道蛋白5(AQP5)在在位内膜上的表达显著高于异位内膜;当干扰AQP5基因的表达后,腺上皮细胞的迁徙能力明显下降,这提示AQP5的表达与腺细胞的迁徙有一定的关系。AQP5蛋白过表达参与了子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的迁徙过程,干扰AQP5基因的表达可以抑制子宫内膜腺细胞的迁徙。在AM的发生过程中,细胞迁徙也是内膜种植的一个重要步骤,这提示AQPs可能在AM中子宫内膜的迁徙过程中发生作用,但具体的信号传导通路以及对子宫内膜细胞的迁徙作用尚不明确。子宫腺肌病是一个雌激素依赖性疾病,子宫肌层局部处于高雌激素状态。研究发现AM病灶处有芳香化酶P450异常升高,芳香化酶的异常升高导致了病灶局部环境的雌激素合成过高。既往也有研究发现雌激素可以通过上调AQP5的表达,从而促进内异病灶的形成。但在AM中尚无类似研究,高雌激素与在位内膜迁徙之间的关系尚不清楚。本实验通过研究雌激素与AQP4,5,8结合及AM病灶的内在关系有助于明确AM的发生机制,有可能为AM治疗药物的研发提供一个新的潜在的分子靶标。研究目的:研究AQPs在AM在位内膜和异位内膜中表达水平,并在体外细胞水平研究AQPs在雌激素介导下参与AM发病的机制。材料和方法:(1)选取2017-2018年在浙江大学医学院附属妇产科医院行子宫切除手术,经病理证实为子宫腺肌病的患者作为实验组,取其子宫在位内膜与异位病灶进行实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)及免疫组化检测样本中AQP4,5,8的表达水平。另选择同期因子宫功能性出血行全面诊刮术及子宫切除患者,经病理证实为正常子宫内膜患者的子宫内膜和子宫肌层作为对照组同法处理。所有患者无内科合并症,术前3个月内未行激素治疗。(2)选取同期于浙江大学医学院附属妇产科医院行子宫切除手术经病理证实为子宫腺肌病患者的病灶组织,进行体外分离培养子宫内膜基质细胞并传代,加入17-β雌二醇(Estradiol,E2)及雌激素选择性抑制剂(ICI182,780)或不同信号通路抑制剂(AG1478,BEZ235,H89),免疫印迹实验检测基质细胞中AQP4,5,8的表达水平和四条信号通路(PI3K-AKT、ERK、P38、SAPK)的磷酸化的变化,采用RTCA法检测细胞增殖,划痕实验和侵袭实验(Transwell法)检测细胞雌激素对子宫内膜基质细胞的迁移和侵袭能力的影响。优选出AQP5为候选基因,构建可靶向沉默AQP5基因的质粒,包装形成病毒颗粒后感染原代培养的子宫内膜基质细胞,RT-qPCR及免疫印迹法检测子宫内膜基质细胞中AQP5 mRNA和蛋白表达的改变;划痕实验、Transwell法及凋亡实验检测干扰后基质细胞的迁徙及生长能力的改变。(3)所有采用SPSS 16.0软件进行统计分析,结果表示为平均值±标准差,图中*,**,***代表P<0.05,<0.01,<0.001,表示有统计学差异。结果:1.相对于正常子宫内膜组织及肌质,腺肌病组中在位内膜及异位病灶中AQP4,5,8表达明显增多;2.体外实验证明,E2上调子宫内膜基质细胞中AQP4,5,8的蛋白表达,E2促进了信号通路MAPK、PI3K-AKT的激活。当添加AG1478(MAPK抑制剂)或BEZ235(PI3K抑制剂)信号通路抑制剂后,内膜基质细胞中AQPs的蛋白表达量、信号通路的激活被减弱。3.E2促进子宫内膜基质细胞的迁移和侵袭,雌激素受体抑制剂(ICI182,780)不能完全抑制雌激素的作用,而AG1478和BEZ235两种信号通路抑制剂均能有效的抑制E2促进细胞迁徙的作用(p<0.05)。4.E2促进子宫内膜基质细胞的侵袭,加入雌激素抑制剂(IC1182,780)联合处理后细胞侵袭能力减弱(p<0.05)。5.AQP5基因干扰后,干扰组子宫内膜基质细胞AQP5 mRNA及蛋白水平均降低,干扰组子宫内膜基质细胞的迁移、侵袭、生长能力均下降(p<0.01,p<0.05,p<0.05)。结论:E2通过促进AQP4,5,8的表达,激活PI3K-AKT通路和MAPK通路,进而促进子宫内膜细胞的增殖、迁移和侵袭,可能导致子宫腺肌病的发生。