【摘 要】
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目的:该研究选用雄性中华大蟾蜍作为试验动物,利用RT-PCR技术进行雌激素依赖性基因-卵黄蛋白原(VTG)编码基因的筛选,在此基础上研究该基因表达与雌激素、类雌激素的剂量依赖
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目的:该研究选用雄性中华大蟾蜍作为试验动物,利用RT-PCR技术进行雌激素依赖性基因-卵黄蛋白原(VTG)编码基因的筛选,在此基础上研究该基因表达与雌激素、类雌激素的剂量依赖性关系和时间-效应关系,以建立一种中华大蟾蜍原代肝细胞模型,为内分泌干扰作用机理的研究和环境内分泌干扰物质的筛选提供一种快速、灵敏、可靠的方法.方法:选取2-3岁龄、体重60-70g的成年雄性中华大蟾蜍,乙醚麻醉,背侧淋巴囊注射3 000U肝素,在室温下心室插管进行肝脏原位灌注,0.5﹪胰蛋白酶和0.01﹪EDTA混合消化,分离培养肝细胞,静置4小时待细胞完全沉降后进行染毒.收集不同染毒条件下的中华大蟾蜍原代肝细胞各10<6>个,提取总RNA,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测目的基因的表达:Ⅰ.中华大蟾蜍雌激素依赖性基因的筛选Ⅱ.目的基因测序和同源性分析;Ⅲ.雌二醇(E2)与目的基因mRNA表达的时间-效应关系的研究;Ⅳ.雌二醇(E2)与目的基因mRNA表达的剂量依赖性关系的研究;Ⅴ.内分泌干扰化学物己烯雌酚、双酚A对目的基因mRNA表达的影响.结论:我们利用RT-PCR技术成功地从中华大蟾蜍原代肝细胞中筛选出了一段雌激素依赖性基因,该基因是雌激素存在的一个灵敏特异的生物标志,经同源性分析推断目的片段很可能是VTG编码基因的一个片段.在此基础上建立起了一种中华大蟾蜍原代肝细胞筛选模型,该模型具有较高的灵敏度和特异性,可用于内分泌干扰物质特别是类雌激素物质的筛选.
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