帕金森病(PD)发生的根本原因在于大脑黑质-纹状体系统多巴胺能神经细胞退行性病变，引起多巴胺能神经元大量丧失以及多巴胺(DA)的耗竭，从而导致锥体外系功能失调。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)是一种神经毒素，经大量研究证实可以成功地诱导帕金森病动物模型，提示MPTP可能与PD等神经退行性疾病的发生有关。MPTP本身对细胞并无毒性，只有被线粒体中的单胺氧化酶B催化生成它的吡啶类代谢产物MPP~+之后，才对多巴胺能神经细胞产生毒性作用。近年来研究表明凋亡可能是神经退行性病变中细胞死亡的主要方式，可能在环境毒物诱导帕金森病发生的机制中起到重要作用。 丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路是生物信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，对MAPKs的调节涉及细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等多种细胞生理过程。其中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路主要参与细胞增殖与分化的调控，而p38及c-Jun氨基末端激酶(JNK／SAPK)通路的激活参与了不同刺激所致凋亡的启动。另外，并行的MAPKs信号通路之间可以相互协调、相互调控。 近年来，有关MPP~+与多巴胺能神经细胞生长、增殖以及凋亡之间关系的研究受到了广泛关注，许多学者试图证明细胞凋亡及MAPKs通路在MPP~+诱导帕金森综合征的机制中的贡献。初步的研究发现较低剂第四军医大学硕士学位论文量的MPP+短时间作用于多巴胺能神经细胞可能诱导其磷酸化ERK水平增高，但也有降低的报道。另外，MPP+可以诱导细胞磷酸化刀NK表达升高，并且casPases激活等现象提供了细胞发生凋亡的证据。由于实验条件不同，研究结果不尽一致。一般认为低浓度MPP+短时间作用可诱导磷酸化ERK的表达增高，对细胞的增殖、分化产生一定的影响;而较高剂量、较长时间的作用则会产生毒性。 基于以往的实验结果，我们选择多巴胺能的大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12为实验对象，研究MPP+对多巴胺能神经细胞的毒性作用。筛选MPP+对神经细胞增殖抑制作用的剂量一效应及时间一效应关系以及对细胞凋亡的影响，探讨在此过程中细胞MAPKs信号转导通路蛋白活化表达的特点及其相互之间的关系。旨在寻找MPTP等PD相关环境危险因子对大脑黑质一纹状体系统损伤的分子机制，以期揭示PD等神经退行性疾病的病因学基础，并为制定其相关环境危险因子的暴露剂量、临床预防及治疗提供一定的实验依据。方法 取对数生长期PC12细胞，使用含有100一700林mo比MPP+的即Ml1640培养液，分别作用1一7d后，用MTT法测定细胞生长活力并绘制细胞生长曲线:细胞计数法测定MPP+对细胞生长增殖的抑制率，筛选MPP+的细胞毒性剂量范围;采用透射电镜、流式细胞仪及TUNEL法观察凋亡细胞的形态和数量:Westem blot法检测细胞ERKI/2及p38蛋白的活化表达情况;TUNEL法观察阻断ERK及p38通路对MPP+所诱导细胞凋亡的影响。结果 细胞生长抑制实验中，MTT法和细胞计数法检测结果一致显示MpP+对Pc12细胞的生长、增殖可以产生呈剂量一依赖性及时间一依赖性的抑制作用。其中300一500林moFL MPP+作用4d对细胞的抑制率达40%心60%(P<0 .01)，细胞生长曲线也相应发生改变。提示MPP+对多巴胺能神经细胞PC12可以产生显著的增殖抑制作用。 透射电镜观察发现MPP+可诱导PC12细胞发生凋亡的超微结构改变;流式细胞仪检测显示MPP+可以使细胞凋亡率比对照组显著增高萦四军医大学月可d卜学位论文(P<0.01):TUNEL检测结果表明Mpp+作用后TUNEL染色阳性细胞显著增多(P<0.01)。上述结果一致提示MPP+对PC12细胞生长、增殖的抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。 从阳stem blot结果显示MPP+可以使PC12细胞磷酸化ERKI/2的表达下降，而使磷酸化p38的表达量增高，并均呈剂量一效应和时间一效应关系(p<0.01)。100、300、500林mo比Mpp+作用4d后磷酸化 ERKI/2水平分别为对照组的35.4%、27.6%和18.4%;300林mo讥MpP+作用1、2、4、6d时，ERKI/2磷酸化水平分别降低至对照组的47.9%、37.1%、28.5%和10.3%;使用ERK通路特异性阻断剂PD98059可以抑制MPP+对磷酸化ERKI/2表达的下调，而且TUNEL染色阳性细胞数也显著减少(P<0.01)，表明MPP+通过抑制MEKI/2的磷酸化而下调其下游E双l/2的磷酸化水平。100、300、500林mol/L MPP+作用4d后，p38磷酸化水平比对照组分别增加1.7、4.3和6.7倍:300娜ollLMpp+作用l、2、4、6d时，p38磷酸化水平比对照组分别增加1 .1、2.5、4.7和7.4倍;使用p38通路特异性阻断剂sB203580可以抑制MPP+对p38磷酸化的上调，TtJNEL染色阳性细胞数也显著减少伊<0.01)，表明MpP+通过增加磷酸化MEK3/6的表达而上调其下游p38的磷酸化水平，从而诱导细胞凋亡。上述实验结果提示MPP+引起的细胞磷酸化ERKI/2水平的降低和磷酸化p38水平的增高可能是MPP+诱导PC12细胞生长、增殖抑制和凋亡的重要机制。结论 MpP+可以显著地抑制PclZ细胞的生长和增殖。诱导凋亡可能是MPP+的神经毒作用的重要机制之一。其分子机制可能是通过州叭卫Ks信号转导通路的协调反应实现的。随着MPP+作用浓度的增高、作用时?