课题背景:放射性肺损伤常发生于胸部肿瘤放射治疗和核事故、核武器袭击等事件造成的急性全身放射中。放射性肺损伤的主要临床表现为肺泡间质的炎性浸润、进行性呼吸困难、肺功能恶化并最终导致呼吸功能衰竭。放射性肺损伤的发生,极大程度上降低了接受胸部照射病人的预后生存率。目前临床上,除了使用肾上腺皮质激素对症治疗外,尚无有效的治疗药物。放射性肺损伤的发生原因,学术界并未有统一的结论。主流观点认为,其主要发病机制为电离辐射诱导的多种炎症细胞、成纤维细胞及其相关的细胞因子免疫失衡,造成成纤维细胞过度增殖迁移和细胞外间质(ECM)沉积有关,同时,羟自由基受到电离辐射的激发,从而对机体产生了损伤。目前,对于放射性肺损伤的临床治疗,尚缺乏理想的特效药物。传统的放射防护药物在正常肺组织发挥放射防护作用的同时,对肿瘤细胞也提供了一定的防护效果。该药物特点极大地降低了肿瘤放疗的效果,制约了其在临床肿瘤病人胸部放疗中的应用。因此,在放射性肺损伤的临床治疗中,迫切地需要寻找一种疗效显著、毒副作用小、安全性高的新型防护药物。虎杖苷(Polydatin,PD),是在自然界广泛存在的一种天然活性成份,广泛存在于中药虎杖的根和茎。虎杖苷来源广泛,具有明确的分子结构,易于人工合成,价格低廉,目前已广泛应用于人体的日常保健中。虎杖苷是一种强效的自由基清除剂,同时具有抗炎、抗氧化、保护血管内皮细胞的作用。除此之外,更令我们感兴趣的是,虎杖苷还对多种人体肿瘤细胞产生杀伤作用。该药物的半数致死剂量超过1000mg/kg,远远大于其治疗剂量,毒副作用小,表现出较好的生物安全性。结合虎杖苷的特点,我们认为,该药物在临床胸部肿瘤放射治疗等原因所致的放射性肺损伤中存在着巨大的潜在价值。研究主要内容:1、虎杖苷对放射性肺损伤的防护作用:(1)虎杖苷对电离辐射诱导的肺组织大体及肺系数改变的影响;(2)虎杖苷对电离辐射诱导肺组织病理学改变的影响;(3)虎杖苷对电离辐射诱导的上皮细胞间质转化的影响;(4)虎杖苷对电离辐射诱导的肺上皮细胞损伤的影响。2、虎杖苷的防护机制:(1)虎杖苷对TGF-β1/Smad3/Snail通路的影响;(2)虎杖苷对促纤维化因子TGF-β1及ET-1分泌的影响;(3)虎杖苷对th1/th2细胞免疫失衡的影响;(4)虎杖苷对放射性肺损伤相关炎性细胞因子分泌的影响;(5)虎杖苷对羟自由基、sod、mda表达水平的影响;(6)虎杖苷对潜在靶点sirt蛋白家族表达的影响。3、虎杖苷对肿瘤生长的抑制作用:(1)小鼠肺部荷瘤模型的建立;(2)虎杖苷对荷瘤小鼠生存率的影响;(3)虎杖苷对荷瘤小鼠肺组织大体改变的影响;(4)虎杖苷对荷瘤小鼠肺组织病理学改变的影响;(5)虎杖苷对肺癌细胞的抑制作用。实验研究方法:1、建立小鼠放射性肺损伤模型:使用本教研室自行设计的c57bl/6小鼠模具固定,使小鼠四肢充分伸展,暴露小鼠口鼻于模具外侧,选取回形针作为固定工具,分别固定小鼠的四肢及尾部。用铅砖遮挡小鼠胸部以外区域后,采用15gy大剂量单次照射,剂量率1gy/min。2、虎杖苷对放射性肺损伤的防护作用:(1)动物分组及处理:将120只c57bl/6雌性小鼠随机分为4组,即对照组、单纯照射组、虎杖苷处理组、wr2721处理组,分别进行相应的处理;(2)对比接受电离辐射后,各组小鼠肺组织大体及肺系数改变情况;(3)病理组织变化情况:分别对各组小鼠肺组织进行h&e染色、masson’strichrome染色、免疫组化染色、tunel染色;(4)肺组织上皮细胞间质转化(emt)情况对比:通过westernblot及免疫荧光染色的方法,检测肺组织间质标志物α-肌动蛋白(α-sma)、波形蛋白(vimentin)以及上皮标志物e-钙黏素(e-cadherin)表达的变化情况;(5)比色法检测肺组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,hyp)的表达情况;(6)细胞处理:选取人支气管上皮细胞beas-2b,检测虎杖苷是否对电离辐射诱导的细胞损伤具有防护作用;(7)细胞增殖能力检测:cck-8、克隆形成率。3、虎杖苷的防护机制:(1)用免疫组化染色,检验虎杖苷对tgf-β1/smad3/snail通路的作用;(2)用elisa的方法,检测肺组织tgf-β1、et-1、ifn-γ、il-4、il-13、pge2、tnf-α等细胞因子的表达情况;(3)用esr的方法,检测虎杖苷对于羟自由基的清除能力;(4)检测虎杖苷对于肺组织中sod、mda表达量的影响;(5)细胞处理:选取人支气管上皮细胞beas-2b,检测虎杖苷对细胞内sirt家族蛋白表达的影响。4、虎杖苷对肺癌细胞的抑制作用:(1)建立小鼠肺部荷瘤模型:使用dmem培养基重悬吹匀小鼠路易斯肺癌细胞llc,配制成2×106浓度的细胞悬液后备用。用10%水合氯醛麻醉小鼠后,使其左侧卧于手术台上并固定。消毒后,于小鼠胸骨剑突右侧10mm处,切开皮肤并剥离右侧胸壁前肌层,暴露小鼠胸腔壁层及肋间隙,可见其活动的右下肺叶。在肉眼直视状态下,通过小鼠右下第一或第二肋间隙垂直进针,进针深度5mm,注射细胞悬液25μl。逐层缝合小鼠肌层及皮肤,再次消毒,并使其复温苏醒;(2)通过大体观察,对比虎杖苷处理组与对照组肺部肿瘤组织的生长情况;(3)通过病理切片,对比虎杖苷处理组与对照组肺部肿瘤组织的生长情况;(4)通过活体成像,对比虎杖苷处理组与对照组肺部肿瘤组织的生长情况;(5)在细胞学水平,验证虎杖苷对肺部肿瘤细胞的抑制作用。技术路线:实验结果:1、虎杖苷对放射性肺损伤的防护作用:(1)肺组织大体观察与肺系数对比显示,虎杖苷能够显著减轻电离辐射诱导的肺部出血、充血、水肿程度,从而控制肺系数的上升;(2)对比h&e染色、masson染色和tunel染色结果,虎杖苷在肺组织受照早期和晚期,均表现出明显的炎症抑制、纤维素渗出抑制作用,同时可显著抑制电离辐射诱导的细胞凋亡;(3)羟脯氨酸含量检测显示,虎杖苷对于电离辐射诱导的羟脯氨酸升高具有显著的抑制作用;(4)免疫荧光与westernblot结果显示,虎杖苷对于电离辐射诱导的emt有显著的抑制作用;(5)细胞学结果显示,虎杖苷对于电离辐射诱导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。2、虎杖苷的防护机制:(1)免疫组化结果显示,虎杖苷对于促纤维化作用的tgf-β1/smad3/snail通路有着显著的抑制效果;(2)虎杖苷显著地抑制了促纤维化因子tgf-β1和et-1的升高;(3)在虎杖苷处理组,th1和th2细胞免疫失衡引发相应细胞因子的升高受到了显著的抑制,提示虎杖苷对于电离辐射诱导的th1/th2细胞免疫失衡具有一定的调节作用;(4)虎杖苷能够延缓pge2的下降,同时显著抑制tnf-α的升高,提示虎杖苷具有较强的抗炎作用;(5)虎杖苷具有显著的抗氧化能力,能够迅速地清除大量羟自由基、抑制肺组织内sod的下调与mda的上调;(6)虎杖苷对sirt蛋白具有显著的激动效果,尤其对于sirt3、sirt6的激动效果更为显著,提示sirt蛋白可能是虎杖苷潜在的作用靶点。3、虎杖苷对于肺癌细胞的抑制作用:(1)成功建立了小鼠肺部荷瘤模型;(2)虎杖苷能够显著提高荷瘤小鼠的生存率;(3)虎杖苷能够显著延缓肺部肿瘤的生长;(4)虎杖苷对于肿瘤细胞存在一定的抑制作用。结论:虎杖苷能够有效缓解电离辐射诱导的肺组织病理改变,减轻肺水肿,抑制上皮细胞间质转化的过程,从而对电离辐射诱导的放射性肺损伤产生防护效应。细胞学水平上,虎杖苷显示出同样的防护效果。虎杖苷可能通过抑制TGF-β1/Smad3/Snail通路、减少促纤维化因子和炎性细胞因子的释放、调节Th1/Th2细胞免疫失衡、提高体内Sirt蛋白的表达、抗炎抗氧化等方式,发挥其放射性肺损伤的防护作用。本研究成功建立了建立了小鼠肺部荷瘤模型,并通过该模型,证明了虎杖苷能够显著提高荷瘤小鼠的生存率、延缓肺部肿瘤的生长、同时对于肿瘤细胞存在一定的抑制作用。综上所述,虎杖苷具有高效低毒、价格低廉、抗炎抗氧化、调节机体免疫反应的特点,同时又能够延长肺部荷瘤小鼠的生存时间、延缓肿瘤细胞的生长发育,在临床肺癌放疗中存在着巨大的潜在价值。