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麻疯树(Jatropha curcas L.),大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)落叶灌木或乔木。其种子含油量高(50%~60%),目前已被视为一种提炼生物柴油的新兴能源物质,然而种子的形成,离不开花的发育。GASA(GA-Stimulated in Arabidopsis)是一类位于DELLA下游受赤霉素调节的基因家族,该家族成员在植物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究通过对麻疯树转录组测序结果的分析,获得了GASA基因家族的一个同源基因的部分序列。通过对该基因的克隆获得了其全长序列,命名为JcGASA6,并在此基础上对该基因进行了花发育过程中的表达分析,亚细胞定位以及原核表达,从而对麻疯树JcGASA6基因的功能进行了初步的探索,也为GASA蛋白在赤霉素信号转导途径中的作用提供线索和依据。通过本文研究,结果如下: 1.麻疯树JcGASA6的克隆及序列分析 结合RT-PCR和RACE-PCR技术,从麻疯树花蕾中克隆了得到了JcGASA6基因的全长序列。通过生物信息学分析结果显示,该基因全长cDNA为859bp,开放阅读框为327bp,共编码108个氨基酸,且该基因编码的蛋白质存在信号肽,以及GASA功能结构域。 2.JcGASA6在麻疯树花不同发育时期的表达 利用RT-qPCR分析了麻疯树花发育过程中9个重要时期的表达量(未分化时期、大孢子母细胞时期、大孢子母细胞分裂期、单核胚囊期、胚囊成熟期、小孢子母细胞时期、四分体时期、单核花粉粒时期以及花粉粒成熟期),结果显示JcGASA6在雌花与雄花中的表达量差异明显。在雄花发育过程中,JcGASA6表达量从未分化时期开始缓慢增加,直至单核花粉粒发育至成熟时期这一阶段,其表达量骤然增加,到达雄花花粉粒成熟时期,表达量达到最大值。而在雌花发育过程中,JcGASA6从未分化时期开始先增加,至大孢子母细胞时期达最大,之后在大孢子母细胞减数分裂期其表达量开始减少,直至到达成熟胚囊时期,表达量达到最低。 3.JcGASA6的亚细胞定位 通过构建pBWA(V)HS-GASA6-osgfp瞬时表达载体,对JcGASA6进行了亚细胞定位分析,初步定位和精确定位结果都显示,JcGASA6基因的表达产物定位于液泡膜。 5.JcGASA6的原核表达 通过构建麻疯树原核表达载体pCold II-JcGASA6,同时导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG浓度为0.25mM和0.10mM时的蛋白量表达量差异不明显,诱导时间为16小时比4小时的表达量高;可溶性分析研究结果显示JcGASA6在大肠杆菌细胞内的表达主要是以包涵体的形式存在;质谱鉴定结果得出JcGASA6蛋白的分子量为10.971KDa,等电点为9.24;JcGASA6蛋白质的分析结果显示,JcGASA6蛋白是一种亲水性蛋白,存在α螺旋,β-转角,无规则卷曲这几种结构,同时还存在一个跨膜区段;JcGASA6与拟南芥 GASA家族进行多重序列对比,发现JcGASA6的氨基酸序列与AtGASA家族的氨基酸序列存19个高度保守位点,其中包含12个半胱氨酸位点,这12个氨基酸形成了6个二硫键。