20世纪60年代在威斯康辛州的火鸡鸡体内分离出H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)以来,该病毒已经在世界范围内传播。为控制H9N2亚型禽流感病毒的传播,中国内地已广泛实施H9N2亚型禽流感病毒疫苗接种计划。虽然这项免疫计划有效地减少了 H9N2亚型禽流感病毒对鸡群造成的经济损失,但它并未阻止H9N2亚型禽流感病毒在中国大部分地区的传播。为了研究H9N2亚型禽流感病毒的演化,早前本实验室已经在鸡胚中对H9N2亚型禽流感病毒进行连续传代,另外也对混合的H9N2亚型禽流感病毒在SPF鸡体内连续传代进行了相关研究,观察到传代病毒在抗原性和致病性等方面的变化。为了减少混合病毒对研究结果的干扰,探究病毒在每只鸡个体内传代后的变异情况,在本试验中我们选择在疫苗抗体选择压下的鸡体中进行一对一单传的传代模式,即以A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2,F/98)禽流感病毒为研究对象,将F/98株病毒在有和没有同源疫苗抗体选择压力下的SPF鸡体内连续一对一传代,通过HI试验和分子生物学等技术分析所得的传代病毒的抗原漂移、遗传进化及其病毒毒力的变化情况,为禽流感的疫苗防治工作提供新的理论基础。1.F/98株分别在有和没有疫苗抗体选择压下的鸡体内的连续传代及其抗原性和鸡胚感染力分析将6只21日龄的SPF鸡分为有疫苗抗体选择压传代组(V)和无疫苗抗体选择压传代组(N)两组,每组各三只。V组建立三个独立传代系列V1、V2和V3,用F/98株油乳剂灭活疫苗分别经肌肉和皮下注射免疫,免疫后待血清中的抗体滴度HI值为24时,进行感染实验;N组建立三个独立传代系列N1、N2和N3,直接进行感染实验。所有V组和N组的第一代传代系列均用同一批次收集的F/98株的病毒尿囊液,将病毒按照106 EID50/0.2mL的剂量分别对SPF鸡进行感染,感染途径为滴鼻、点眼和灌喉。感染后3d分别取各个传代系列实验鸡的肺和气管,分别制备四抗PBS的组织研磨液,并置于-70℃冻存备用,此为第一代有和没有疫苗抗体选择压下传代的组织均浆液。接着取6只21日龄的SPF鸡,按上述同样方法分组,以此方法类推,共进行到第9代次的传代系列。取第5代次和第9代次的肺和气管的组织匀浆液分别接种10日龄鸡胚,分离获得在有和没有疫苗抗体选择压的鸡中传代的病毒尿囊液;将分离收集的病毒尿囊液与母本病毒F/98株的阳性多抗血清进行HI实验。结果显示,与母本病毒F/98株的HI效价相比,有疫苗抗体选择压下第5代次肺组织分离的传代病毒(简称V5L)、无疫苗抗体选择压下第5代次肺组织分离的传代病毒(简称N5L)、有疫苗抗体选择压下第5代次气管分离的传代病毒(简称V5T)和无疫苗抗体选择压下第5代次气管分离的传代病毒(简称N5T)的HI均没有明显差异;然而,有疫苗抗体选择压下第9代次肺组织分离的传代病毒(简称V9L)和无疫苗抗体选择压下第9代次肺组织分离的传代病毒(简称N9L)的HI效价下降了 8倍。同时,有疫苗抗体选择压下第9代次气管分离的传代病毒(简称V9T)和无疫苗抗体选择压下第9代次气管分离的传代病毒(简称N9T)的HI效价下降了 16倍。这些结果表明,经过5个代次的传代后,相比母本病毒F/98株,传代病毒的抗原性基本没有变异;而经过9个代次的传代后,与母本病毒F/98株相比,传代病毒抗原性均发生了明显的变异。第9代次的传代病毒在有和没有疫苗抗体选择压下的适应性不仅包括抗原性变化,而且还表现出对鸡胚感染力和致死力的变化。V9L和V9T病毒的EID50是母本病毒F/98株的1.77倍,二者无明显差异;而N9L和N9T病毒的EID50分别是母本病毒F/98株的25.4倍和17.7倍,传代病毒的鸡胚感染力显著提高。此外,与F/98株相比,V9L和V9T病毒丧失了致死鸡胚的能力,而N9L和N9T病毒的ELD50仅提高了 0.77倍,与母本病毒无明显差异。综上所述,没有疫苗抗体选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力相比母本病毒有了显著提高,而有疫苗抗体选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力相比母本病毒变化不大,但丧失了致死鸡胚的能力。2.F/98株病毒的第9代次传代病毒的基因分析将第9代次的优势传代病毒与亲本病毒F/98株相比,除了病毒的抗原性发生改变,各基因片段的部分氨基酸也发生了变化。与母本病毒相比,V9L病毒共计发生了 13个氨基酸突变,其中 PB2 基因 5 个(T296K,A322E,R327K,H366Q,Y369S)、PB1 基因 2个(T251V,A669G)、HA 基因 2 个(K131R,A198V)、NP 基因 1 个(A100R)、NA基因1个(C385T)、M基因2个(P154A,A246Q);V9T病毒共计发生了 11个氨基酸突变,其中 PB2 基因 4 个(A322E,R327K,H366Q,Y369S)、PA 基因 1 个(S148H)、HA 基因 2 个(A198V,Q234L)、NP 基因 1 个(G45T)、NA 基因 1 个(C385T)、M基因2个(P154A,A246Q);N9L病毒共计发生了 20个氨基酸突变,其中PB2基因6个(T138A,T296K,I298Q,R327K,Y369S,E526R)、PB1 基因 1 个(T348A)、PA基因 4 个(S148H,L336M,K544M,S640K)、HA 基因 2 个(N167G,N285S)、NP基因 3 个(G52A,D65L,L187G)、M 基因 2 个(H23I,T331A)、NS 基因 2 个(S81L,H85S);N9T病毒共计发生了 18个氨基酸突变,其中PB2基因5个(T296K,I298Q,R327K,Y369S,E526R)、PB1 基因 1 个(T348A)、PA 基因 2 个(S148H,L336M)、HA 基因 3 个(A198V,Q234L,N285S)、NP 基因 4 个(G52A,S65L,L187G,G419V)、M基因1个(H23I)、NS基因2个(S81L,H85S);此外,V9L和V9T病毒的NA蛋白在67-76位缺失10个氨基酸(A67-76)。这些结果显示,抗体选择压使病毒的NA蛋白发生67-76位氨基酸缺失;抗体选择压下的传代病毒氨基酸突变数量明显少于没有抗体选择压下的传代病毒氨基酸突变数量;肺组织分离到的传代病毒氨基酸突变数量略多于相同传代条件下气管中分离到的传代病毒氨基酸突变数量。综上所述,在有和没有疫苗抗体选择压下连续传代9代次,H9N2亚型禽流感病毒F/98株的抗原性都发生了变异;抗体选择压使F/98株失去致死鸡胚能力,NA蛋白发生67-76位氨基酸缺失,使F/98株基因组突变数显著少于无抗体选择压下传代的病毒。这些结果表明,疫苗抗体选择压力对H9N2亚型禽流感病毒的进化及其一些生物学特性的变化具有重要作用。