CRISPR-Cas是存在于细菌和古细菌中用来防御外源DNA入侵的获得性免疫系统。根据这一特点,科学家基于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（即SpyCas9）开发出了基因编辑系统。由于SpyCas9具有设计简单、操作简便、周期短、成本低等优势,短时间内迅速风靡全球生物、医学及其它相关实验室。目前,SpyCas9作为一种强有力的基因编辑工具已应用于医疗、农业、畜牧等多个领域。但该工具存在脱靶编辑、具有一定细胞毒性、进入细胞后活性无法控制等问题。所以,亟需一个方法控制SpyCas9的活性,在基因编辑完成后能够关闭其活性,使细胞免受SpyCas9的伤害。而Anti-CRISPR蛋白的发现无疑为这一方法提供了有效思路,Anti-CRISPR蛋白是噬菌体为了抵抗CRISPR-Cas系统而进化的产物,不同Anti-CRISPR蛋白可以不同程度的抑制对应类型的CRISPR-Cas系统。因此,本文选用了作用机制已被报道的AcrⅡA2、AcrⅡA4和AcrⅡA5这三个SpyCas9抑制剂,对其功能和活性进行了深入研究。第一,为了验证现有抑制剂的活性,本研究构建了基于抗生素筛选的高效双质粒功能验证系统。该系统由一个具有编辑功能的质粒和另一个含有抑制剂基因的质粒构成,通过抗生素抗性修复与否来确定SpyCas9对DNA的切割效果和抑制剂的抑制效果。结果表明,在确定SpyCas9高效切割靶点的基础上,AcrⅡA4高效地抑制了SpyCas9的编辑功能,而AcrⅡA2对SpyCas9抑制效果不明显。第二,建立起高效的基于LacZ基因的SpyCas9对大肠杆菌基因组DNA编辑和抑制剂抑制效果检验系统。由于上述双质粒功能验证系统靶点设计在质粒上,质粒在细菌内有一定的拷贝数,为了排除拷贝数可能产生的影响,更为了检验上述试验结果是否具有广谱性,将切割靶点设计到BL21（DE3）基因组的LacZ基因上,并根据靶点设计相应的同源修复模板。经修复后的LacZ基因会发生移码突变,通过转化细菌的颜色和数量就可判断编辑修复情况。再将能有效编辑LacZ基因的编辑系统转入含抑制剂的细菌中,通过菌落数量和颜色来判断抑制剂活性的强弱。试验再次表明,AcrⅡA4具有出色的抑制效果,AcrⅡA2无明显抑制效果。第三,通过定向进化策略提高了AcrⅡA2对SpyCas9的抑制效果。对抑制效果不明显的AcrⅡA2通过易错PCR的方法进行分子改造,构建AcrⅡA2突变体库,并进行高通量的功能筛选。经初筛和复筛后,从850个样本里筛选出一个活性提高的AcrⅡA2突变体。第四,探究了抑制剂AcrⅡA5与APOBEC碱基编辑酶的融合蛋白的作用效果。现有单碱基编辑器编辑效率较低,一个主要原因是脱氨酶与d Cas9（或nCas9）结合率低。为了解决这一问题,本研究设计了AcrⅡA5与APOBEC碱基编辑酶的融合蛋白。AcrⅡA5能与nCas9有效结合但不影响nCas9和DNA形成复合物,本研究期望在AcrⅡA5的帮助下,APOBEC与nCas9的结合效果有所提高,进一步提高其编辑效率。APOBEC的靶点位于BL21（DE3）基因组LacZ的高度保守区域,可通过菌落的颜色判断是否被编辑。试验结果表明,在融合抑制剂AcrⅡA5的情况下,碱基编辑器没有编辑效果,但该融合蛋白的构建为碱基编辑器的改进提出了新思路。总之,本论文构建了两种有效的SpyCas9抑制剂活性筛选系统,并对抑制效果不明显的AcrⅡA2进行了分子改造,使其活性得到提高。而且构建了抑制剂与脱氨酶的融合蛋白,对融合蛋白协同nCas9的单碱基编辑效果进行了初步探究。本论文不仅对SpyCas9抑制剂活性研究提供了重要参考价值,也为SpyCas9活性的控制提供了一种思路。