七鳃鳗(Lamprey)是处于无脊椎动物与脊椎动物之间最重要的物种,从遗传信息基础和其进化地位来看,它印记了无脊椎动物的进化历史,又为脊椎动物的起源与进化提供了丰富的遗传信息基础。几丁质酶是具有裂解几丁质多聚物之间β-1,4-糖苷键能力的一种水解酶,在许多物种中广泛存在。但是,包括人类在内的哺乳动物中,至今尚未发现几丁质的存在,却相继发现了体内存在几丁质酶。近几年研究证明,哺乳动物几丁质酶可能在机体抵抗真菌感染方面扮演重要角色。但是关于其如何抵抗真菌的机制及在不同物种中的进化关系目前还不是很清楚。由于七鳃鳗具有特殊的进化地位,所以通过研究七鳃鳗几丁质酶的功能,可以更帮助理解哺乳动物几丁质酶的进化关系,分析其功能的演变过程。本论文以日本七鳃鳗为研究对象,根据实验室前期所建立的肝脏cDNA文库中的几丁质酶EST序列,利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术克隆了日本七鳃鳗几丁质酶基因,对序列进行了生物信息学分析;利用实时定量PCR、Northern blotting等技术,检测了日本七鳃鳗几丁质酶基因在不同组织和性别中的表达情况;初步研究了日本七鳃鳗几丁质酶的抗菌功能。具体研究结果如下:(1)本研究用RACE技术克隆了日本七鳃鳗几丁质酶基因全长。cDNA序列全长2808bp,其中5’UTR为104bp,3’UTR为1129bp,ORF长为1575bp。(2)经生物信息学分析,该几丁质酶编码了524个氨基酸,N端带有23个氨基酸的信号肽,属于18家族几丁质酶。预测的分子量为57.61KD,理论等电点为7.22。(3)通过与18家族哺乳动物几丁质酶做进化树分析,发现日本七鳃鳗几丁质酶与壳三糖酶、酸性哺乳动物几丁质酶及输卵管糖蛋白有共同的祖先,可能具有参与先天性免疫、适应性免疫反应及发育调控的潜在功能。(4)分析了几丁质酶在日本七鳃鳗各组织中的表达情况,其中在肝脏和唾液腺中高表达,在肠中有较高表达,在生殖腺和血液中低表达或不表达。值得注意地是,该几丁质酶基因在雌性日本七鳃鳗肝脏中的表达量比雄性高100多倍。由于日本七鳃鳗正处于性腺发育阶段,推测动物几丁质酶可能具有参与发育调控的新功能。(5)分别用真菌和细菌在日本七鳃鳗体内注射。菌刺激后几丁质酶在各组织中的表达量显著增加,对四种菌均有不同程度地反应,该现象初步证明了几丁质酶参与先天性免疫应答,可为研究七鳃鳗的免疫模式提供参考。而且也提示了几丁质酶将在临床抗真菌治疗方面具有潜在的应用价值。