目的:本课题的研究目的为通过盲肠结扎穿孔法(CLP法)建立小鼠脓毒症模型,检测T淋巴细胞内铁死亡重要指标随脓毒症严重程度的变化情况,研究T淋巴细胞铁死亡与脓毒症的关系及Nrf2在脓毒症T淋巴细胞铁死亡中的作用。方法:雄性C57BL/6j小鼠共计51只,分为:生存分析组、假手术(对照)组、轻度脓毒症组、重度脓毒症组。生存分析组继续分为假手术亚组、轻度脓毒症亚组、重度脓毒症亚组,观察各时间点小鼠的表现及生存情况。假手术组小鼠在中下腹部腹中线做切口,暴露腹腔,找到盲肠后不做处理立即将盲肠回纳腹腔,关腹缝合。轻度脓毒症组、重度脓毒症组分别在找到盲肠后在距离盲肠远端1/3和2/3交接点处结扎盲肠和部分血管,再用27G针头贯穿扎孔3次后回纳腹腔,关腹缝合。48h后留取小鼠的全血、腹腔灌洗液、脾脏、肺泡灌洗液、肺组织等标本。分别用比色法和考马斯亮蓝法测定肺灌洗液中白蛋白和总蛋白含量,二者相比计算肺通透指数(LPI),观察小鼠有无急性肺损伤发生,并测定肺组织中Nrf2的表达水平。检测小鼠腹腔灌洗液和血清中铁离子、转铁蛋白、铁蛋白的表达水平。检测小鼠外周血及腹腔灌洗液中T淋巴细胞数目;RT-PCR检测各组小鼠T淋巴细胞中caspase 3、caspase 4、caspase 8、caspase 9、caspase 12、Bcl-1、Bax、CHOP mRNA的表达情况;测定各组小鼠T淋巴细胞中ROS、GSH含量;RT-PCR和Western blot法检测各组小鼠T淋巴细胞中Nrf2的表达情况并对比分析;流式细胞仪测定各T淋巴细胞亚群凋亡比例。结果:(1)根据各亚组小鼠的生存情况用SPSS软件进行生存分析,结果可见小鼠死亡率随着脓毒症加重而明显增加。(2)测定肺通透指数(LPI),结果示轻度脓毒症组肺通透指数与假手术组相比无显著差异,但重度脓毒症时肺通透指数升高,出现急性肺损伤。说明脓毒症模型构建成功。(3)测定肺组织中Nrf2的表达水平:WB检测肺组织中Nrf2蛋白及其磷酸化水平表达情况,结果示轻度脓毒症组中的表达量较假手术组略有降低,而重度脓毒症组中的表达量较假手术组明显升高。磷酸化的Nrf2在各动物间表达差异较大,但重度脓毒症组中的表达量较假手术组还是有所升高。RT-PCR检测Nrf2在mRNA水平表达情况,结果示Nrf2的mRNA表达水平在轻度脓毒症组小鼠中略有升高,且在重度脓毒症组小鼠中显著升高。(4)检测小鼠腹腔灌洗液中铁离子、转铁蛋白、铁蛋白含量,结果显示:重度脓毒症组小鼠腹腔灌洗液中的铁离子、铁蛋白、转铁蛋白含量较假手术组均有所升高。(5)检测小鼠血清中铁离子、转铁蛋白、铁蛋白含量,结果显示:重度脓毒症组小鼠血清中铁离子的含量较假手术组显著降低,而血清中铁蛋白和转铁蛋白的含量较假手术组均有显著升高。(6)检测CLP建模后小鼠脾脏中各T淋巴细胞亚群数目变化,结果显示:重度脓毒症组小鼠脾脏中CD3、CD4、CD8的阳性率较假手术组均有显著下降。(7)验证T淋巴细胞死亡是否为铁死亡:RT-PCR检测各组小鼠T淋巴细胞中caspase 3、caspase 4、caspase 8、caspase 9、caspase 12、Bcl-1、Bax、CHOP mRNA的表达,结果可见各基因在轻度脓毒症组中的表达均略有升高,而在重度脓毒症组中除caspase 12外,其余各基因的表达均与假手术组和轻度脓毒症组相比升高显著,caspase 12虽也有升高,但各组间差异较大。轻度脓毒症组小鼠T淋巴细胞中的ROS含量较假手术组略有升高,重度脓毒症组小鼠T淋巴细胞中的ROS含量较假手术组显著升高。轻度脓毒症组和重度脓毒症组小鼠T淋巴细胞中的GSH含量较假手术组均显著降低。Western blot检测各组小鼠T淋巴细胞中Nrf2的表达情况时,Nrf2和p-Nrf2无法得到合适条带。RT-PCR检测结果示:轻度脓毒症组小鼠T淋巴细胞中Nrf2的表达量较假手术组略有升高,重度脓毒症组小鼠Nrf2表达量较假手术组显著升高。用流式细胞术检测各组小鼠T淋巴细胞凋亡比例,结果显示:轻度脓毒症组小鼠与假手术组相比,T淋巴细胞的凋亡比例明显升高,且随着脓毒症加重,凋亡比例进一步增加。结论:通过本课题研究,证明严重脓毒症小鼠T淋巴细胞发生铁死亡,并明确Nrf2在严重脓毒症T淋巴细胞铁死亡中具有重要作用。