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研究背景和目的我们前期研究发现TUSC3(Tumor suppressor candidate3)基因在结直肠癌中高表达且与结直肠癌的进展密切相关,但其在结直肠癌中表达改变的调控机制目前并不清楚。因此,本实验研究了结直肠癌中转录因子E2F1对TUSC3的转录调控作用及两者之间相互作用的关系,并初步探讨可能的分子机制。方法1、生物信息学方法预测可与TUSC3结合的转录因子在www.Genecard.com中预测可与TUSC3结合的转录因子,选择E2F1进行验证。预测的E2F1结合TUSC3的位点在TUSC3基因转录起始附近。2、TUSC3与E2F1在结直肠癌中的表达及生物学功能相关性研究采用Western blot及qRT-PCR技术检测TUSC3蛋白和E2F1蛋白在结直肠癌细胞和组织中的表达量,并分析两者表达之间的相关性。采用免疫组化技术检测E2F1在120对结直肠癌组织与癌旁组织中的表达水平,并分析E2F1表达与临床病理参数间的关系,同时分析E2F1与TUSC3表达水平之间的相关性。采用瞬时转染的方法构建E2F1表达干扰及过表达细胞株,然后分别进行划痕室验、小室侵袭实验、细胞增殖实验(cck8法)、平板克隆等体外功能实验。3.TUSC3受转录因子E2F1的调控在生物信息学方法预测的基础上,采用双荧光素酶报告系统及染色体免疫共沉淀技术进一步明确E2F1对TUSC3的表达调控作用及E2F1与TUSC3启动子的结合序列。采用荧光定量qRT-PCR、Western blot、免疫荧光检测、核浆蛋白分离实验分析过表达TUSC3后E2F1表达水平的改变。4.TUSC3对E2F1调控机制探讨采用蛋白质免疫共沉淀及免疫荧光共定位技术明确结直肠癌细胞中TUSC3与E2F1蛋白相互作用及共定位关系。构建TUSC3稳定干扰及过表达细胞株,采用Western blot方法检测TUSC3过表达/干扰后结直肠癌细胞内E2F1表达的改变。采用PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信号通路抑制剂处理结直肠癌细胞,通过Western blot技术检测E2F1的表达。对结直肠细胞株蛋白去糖基化处理,Western blot检测E2F1分子量的改变。5.统计学分析各组实验结果均采用spss20.0软件进行分析,P值<0.05认为差异有统计学意义。结果1、TUSC3与E2F1在结直肠癌中的表达及相互作用关系分析1.1 E2F1在结直肠癌中的表达水平检测1.1.1Western blot和qRT-PCR结果显示,E2F1和TUSC3在结直肠癌细胞株中均高表达,且两者表达呈正相关(P<0.05)。筛选细胞成功构建E2F1干扰及过表达细胞模型。1.1.2荧光定量qRT-PCR和Western blot结果显示,在随机选取配对结直肠癌及癌旁组织中,TUSC3及E2F1蛋白和mRNA在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。且两者蛋白在结直肠癌组织中的表达呈正相关(P<0.05)。1.1.3免疫组化结果显示,E2F1在结直肠癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织。统计学分析发现,E2F1表达与结直肠癌患者的TNM分期相关(P<0.05)。Spearson秩相关分析显示,结直肠癌中E2F1与TUSC3蛋白总体表达存在正相关性(P<0.05)。1.2结直肠癌细胞体外功能试验干扰E2F1后的SW480、SW620细胞的体外增殖能力、侵袭及迁移能力显著降低(P<0.05);过表达E2F1的LS174T、HCT116细胞的体外增殖能力、侵袭及迁移能力显著增强(p<0.05)。2、E2F1对TUSC3在转录水平的调控2.1 Dual-luciferase report system 及 Chip-qPCR 实验结果表明,E2F1 可与TUSC3启动子区域结合,可明显增强TUSC3启动子的活性从而调控TUSC3表达。2.2采用荧光定量qRT-PCR、Western blot、免疫荧光方法发现干扰或过表达E2F1后的细胞株中TUSC3 mRNA和蛋白表达水平出现了相应的降低或增加;细胞核浆蛋白分离实验发现E2F1过表达后TUSC3在胞浆和胞核内的表达均有所增加,尤以胞浆中的表达强度增加更明显。3.TUSC3对E2F1的调节作用机制的初步研究采用蛋白质免疫共沉淀及免疫荧光共定位技术检测到E2F1与TUSC3存在相互作用及共定位关系。Western blot、免疫荧光、核浆分离实验发现,沉默或过表达TUSC3后,E2F1的表达也随之呈现协同一致的改变;过表达TUSC3可促进E2F1在核中的表达。抑制PI3K/AKT及Wnt/β-catenin通路后,E2F1的蛋白表达明显下降。结直肠癌细胞蛋白去N-糖基化处理后,Western blot检测未发现E2F1蛋白分子量改变。结论转录因子E2F1通过结合TUSC3启动子调节TUSC3基因表达,促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移,同时TUSC3可通过PI3K/AKT及Wnt/β-catenin信号通路正反馈上调E2F1蛋白表达并促进结直肠癌细胞增殖、侵袭迁移。本研究的创新之处1、从临床组织标本、体外细胞中阐明E2F1具有促进结直肠癌增殖和侵袭的作用,在体外细胞中明确了 E2F1可与TUSC3启动子结合从而转录调控TUSC3基因表达;2、从体外细胞和分子水平揭示TUSC3可通过PI3K/AKT及经典Wnt/β-catenin信号通路正反馈上调E2F1表达,从而促进结直肠癌增殖和侵袭。