巴西苏木素是从苏木中提取的一种有效成分,已有研究表明,巴西苏木素具有抗肿瘤活性,但其杀伤肿瘤细胞的机制并不清楚。本文通过MTT法和流式细胞仪分析了巴西苏木素对人类移行膀胱癌T24细胞的毒性效应,进一步基于大规模的表达谱测序分析,探讨了巴西苏木素杀伤肿瘤细胞的作用机制,结果为新药靶的发现及抗癌药物的研发提供重要的理论基础。主要研究内容和结果如下：一、巴西苏木素对人类移行膀胱癌T24细胞的毒性效应用不同浓度的巴西苏木素处理T24细胞,MTT法检测受损伤细胞的比例,发现毒性效应随浓度增加而提高,在64μg/mL时进入平台期,计算获得半数致死浓度(LC50)为32μg/mL；用LC5o剂量处理T24细胞,在不同时间点检测细胞受损伤的程度,发现随着巴西苏木素处理时间的延长,毒性效应也随之增强。结果表明：巴西苏木素对T24细胞的毒性有剂量依赖和时间依赖效应。进一步采用流式细胞仪检测巴西苏木素对T24细胞凋亡及周期的影响,结果发现,巴西苏木素对细胞有较强的毒性作用,处理后活细胞数目明显减少,同时也发现,巴西苏木素可诱导T24细胞在G2期阻滞。二、数字基因表达谱分析及差异表达基因筛选随着新一代测序技术的发展,数字基因表达谱使得我们能快速、准确、经济的检测样本中基因转录水平。我们采用数字基因表达谱系统检测巴西苏木素处理前后基因表达水平的变化。选取32μg/ml的巴西苏木素处理T24细胞6h,生理盐水处理作为对照,提取mRNA后进行数字基因表达谱分析,结果表明：521个基因出现上调,968个基因出现下调。对差异表达基因进行归类分析,发现与细胞凋亡相关的基因有17个发生了显著变化,与细胞周期相关的基因有21个发生了显著变化。结合GO及pathway分析,筛选差异表达基因,共筛选出17个与细胞毒性相关的基因。三、采用Real-time PCR技术对差异表达基因进行验证分析采用Real-time PCR技术对筛选出的17个与细胞毒性相关的基因进行验证,结果发现,Caspase家族中的Caspase3, Caspase8, Caspase9mRNA水平没有发生显著变化,CycD、CycE、CDK2、CDK4、CDK6的mRNA水平均没有发生显著变化。在与死亡受体介导的细胞凋亡通路中TRADD高表达,与对照组有显著差异,FADD、FAS表达没有发生显著变化。热休克蛋白家族中HSP40、HSP70A在巴西苏木素处理3h和6h后表达显著上调,HSP70B在处理3h,6h,12h后表达都显著上调。HSP47在处理后mRNA水平没有显著变化。c-Fos在处理3h,12h后表达显著上调,6h极显著,和对照组相比上调32倍。因此,我们选取变化显著的c-Fos进行深入研究。四、差异表达基因c-Fos的功能研究Real-time PCR结果显示：巴西苏木素处理T24细胞6h后,c-Fos mRNA水平表达显著上调。进一步采用western blot检测c-Fos蛋白水平的变化,发现巴西苏木素处理6h后,c-Fos蛋白水平表达上调。为了研究c-Fos在巴西苏木素细胞毒性中的作用,构建超表达载体,与载体EGFP-N1共转染T24细胞,检测c-Fos mRNA及蛋白水平的变化。结果显示,c-Fos mRNA及蛋白水平都显著上调。进一步观察超表达后对肿瘤细胞的影响,发现c-Fos超表达后肿瘤细胞形态发生变化,细胞变圆,结构松散,透光性降低,贴壁性变差,同时,细胞数目也显著减少。采用MTT法检测c-Fos超表达后细胞活性变化,结果表明,与空载体转染的对照组相比,c-Fos超表达后,T24细胞活性显著降低为33.8%。以上结果表明c-Fos在T24细胞中成功超表达,该基因的超表达导致肿瘤细胞活性显著下降,进而出现死亡。说明c-Fos在巴西苏木素杀伤T24细胞的过程中发挥重要作用。