杏鲍菇(Pleurotus eryngii)是一种集食用、药用、营养、保健价值于一体的珍稀食用菌,现已成为我国工厂化栽培重要的食用菌品种之一。光在食用菌生长发育乃至整个生活史过程中都起着非常重要的作用。目前,有关光照影响杏鲍菇子实体形成及生长发育的机制未见深入报道。本研究利用转录组技术分析了杏鲍菇子实体在光照和黑暗条件下的差异表达,研究了不同光处理对杏鲍菇子实体形成及基因表达的影响,并通过基因敲除技术验证了蓝光受体基因wc-1的功能。主要研究结果如下:(1)光诱导的杏鲍菇子实体形成相关基因转录组分析杏鲍菇满瓶菌丝分别在光照和黑暗条件下出菇,结果表明:光照条件下,杏鲍菇子实体生长良好、菇体形态佳、产量高;黑暗条件下子实体不能感受外界刺激,或成球、或成簇,几乎不能形成菇帽,子实体极小且颜色偏白。杏鲍菇黑暗处理子实体PE_FDC和杏鲍菇光照处理子实体PE_FLC转录组测序(RNA-seq)分析,发现FDC与FLC相比,表达明显上调的有276个基因、下调有317个基因。结合差异基因数据,共筛选到光相关基因69个,其中蓝光受体基因两个。KEGG代谢通路分析结果显示,上调基因集中于过氧化物酶途径、丙酮酸途径、真菌核糖体合成途径和脂肪酸代谢途径等;而下调基因富集于甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢途径、PPAR信号途径、脂肪酸代谢及不饱和脂肪酸合成途径。说明光照影响杏鲍菇子实体生长过程中酶的催化作用、蛋白质合成、能量代谢、细胞生长、分化与凋亡等过程,对杏鲍菇子实体的形成和发育十分关键。(2)不同光质、光强对杏鲍菇子实体生长及wc-1/wc-2基因表达量的影响通过研究不同光质(黑、白、黄、红、蓝)和不同光强(0、500 lx、1000 lx、2000 lx)对杏鲍菇原基形成、子实体形态及wc-1和wc-2基因表达量的影响。结果表明,500 lx蓝光促进原基迅速且大量形成,但不利于子实体生长;红光则既不利于杏鲍菇原基形成也不利于子实体生长。黑暗中,原基形成最少,畸形生长,子实体产量低。短时间(60min)蓝光照射(500 lx)促进wc-1基因大量表达(5.85),wc-2基因对500 lx的黄光照射较为敏感,在光照30 min时,表达量达1.92;而白光照射时,wc-2基因在原基时期表达量最高(2.91)。在一定光强范围内(<1000lx),随着光照强度的增加,子实体产量及wc基因的表达量也迅速增加,菌盖色泽加深,而过高的光强(>2000 lx)则不利于子实体生长。当光强为2000 lx时,wc-1基因在光照15 min后表达量即上升至1.25,降至1000 lx时,wc-1基因表达量在原基时期才升高(1.91),wc-2表达量有一定滞后效应。(3)wc-1基因敲除及转化子的鉴定采用Split Marker法,扩增并获得目的基因wc-1的5’端和3’端分别为712 bp、571 bp非编码序列,同时获得潮霉素磷酸激酶基因hph上下游片段分别为764bp和931bp;通过SOE-PCR两两融合,得长度分别为1476bp和1502bp的重组片段,纯化后构成wc-1基因敲除体系。利用PEG4000介导原生质体转化,再生菌株通过进一步潮霉素抗性筛选,并进行PCR序列验证,最终获得敲除菌株Δwc-A4、Δwc-A5、△wc-A6、△wc-A10 等。(4)wc-1基因在杏鲍菇子实体形成中的功能分析菌丝生长速度测定及菌落形态观察结果显示,敲除菌株菌丝生长极其缓慢,边缘不整齐,菌丝长势弱小;扫描电镜结果显示敲除菌株菌丝干瘪且有断层,菌丝生长脆弱。拮抗实验显示,敲除菌株与出发菌株形成明显拮抗线,表明敲除菌株与出发菌株亲缘关系较远,属于不同的菌株。蓝光处理实验结果表明,敲除菌株原基个数极少(1-2个),子实体产量极低,甚至畸形生长,生长周期显著滞后于出发菌株。在白光出菇实验中,原基生长初期,敲除菌株生长情况与蓝光处理相似,但随着光照和培养时间增加,子实体生长逐渐趋于正常,呈现一定光补偿效应,最终子实体产量及生物学效率(约为30%)低于出发菌株(61.17%)。结果表明wc-1基因在杏鲍菇子实体形态建成中具有重要作用。该研究结果对杏鲍菇生产有重要的意义。