肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs，Tumor necrosis factor receptor associatedfactors)是一类重要的胞浆衔接蛋白，主要参与肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族和toll/白介素-1受体(TIR)家族成员的信号转导。与TNFR的胞浆部分或TRAFs家族成员之间彼此形成二聚体或是三聚体，形成多蛋白信号转导复合物，参与调节NF-κB、JNK等多种信号传导通路，调节细胞的增殖、存活与凋亡。　　 迄今共发现七种不同的TRAFs(TRAF1-7)，其中TRAF2是TRAF家族的核心成员，参与多种细胞内的信号转导，其中最主要的调节来自于TNFR超家族的信号。目前TRAF2在肿瘤中作用的研究已经取得了很大成绩，其异常表达与肿瘤的发生、侵袭和转移都密切相关。TRAF2借助TRAF家族成员羧基端含有的一段共同序列-TRAFs结构域，与TRAF1、TRAF6形成异源多聚体。TRAF1/2异源二聚体，可介导TRAF2与TNFR2胞浆区的作用，促进NF-κB的活化。Micheau等在人纤维肉瘤细胞系中证实，在可溶性的TNF-α激活TNFR1时，TRAF2募集TNFR相关死亡结构域蛋白(TRADD)与受体相互作用蛋白(RIP1)共同形成膜结合促存活复合物Ⅰ，导致NF-κB、JNK激活，促进细胞增殖。TRADD/RIP1/TRAF2复合物与TNFR1分离后，可与Fas相关死亡结构蛋白和caspase8结合为胞浆促凋亡复合物Ⅱ，促进细胞凋亡的发生。　　 但TRAF4在肿瘤中的作用目前还很不清楚，不同研究小组得出的结论甚至严重冲突，有研究认为TRAF4可能是一个抑癌因子，还有研究则得出了完全相反的结论。因此，TRAF4是促癌因子还是抑癌因子目前还没有定论，有待进一步阐明。　　 此外，TRAF4存在着核浆穿梭现象，但目前还不明确TRAF4的核浆穿梭受到哪些因素的调控。有学者研究认为: TRAF4的不同结构域与TRAF4的细胞定位相关。TRAF4的C-TRAF结构使TRAF4分子募集至细胞连接处，TRAF4环指、锌指结构缺失突变体或者TRAF结构缺失突变体仅表达于细胞核;TRAF4环指结构缺失突变体或者C-TRAF结构缺失突变体，仅表达于细胞浆，提示TRAF的中心部分，即锌指结构+N-TRAF可促使TRAF4分子表达于细胞浆。但TRAF4核浆定位的具体机制及不同的细胞定位对乳腺癌细胞生物学行为的影响仍不清楚。曾有学者利用免疫组织化学的方法检测了多种人类良恶性组织的表达，结果发现:TRAF4在多种实体恶性肿瘤中均高表达，且存在胞浆及胞核的表达。在乳腺癌组织中的浆表达明显高于正常乳腺组织，核表达明显低于正常乳腺组织。　　 TRAF2和TRAF4与肿瘤的关系正日益受到关注，但目前还没有关于TRAF2和TRAF4在乳腺癌中表达和相互关系的文献报道。本实验的研究目的是在乳腺癌细胞中，应用质粒转染技术研究TRAF4的核、浆表达分别对乳腺癌细胞生物学功能的影响;通过干扰和过表达TRAF2的表达，分析TRAF2蛋白对TRAF4表达和核、浆定位的影响，及对乳腺癌生物学功能的影响。　　 方法：　　 1、细胞培养　　 在37℃、5％ CO2的培养箱中，人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A用DMEM/F12(1∶1)培养基培养，并添加5％马血清、10μg/ml胰岛素及20ng/ml表皮生长因子。乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s用添加10％标准胎牛血清及100单位青链霉素的DMEM或L15培养基培养。所有上述细胞贴壁生长，每2-3天胰酶消化传代一次。　　 2、细胞免疫荧光染色（间接法）　　 细胞爬片后，4％多聚甲醛室温固定，0.2％ Triton X-100处理15分钟，1％ BSA封闭30分钟，滴加抗TRAF2鼠抗人单克隆IgG抗体，或抗TRAF4兔抗人多克隆IgG抗体，4℃孵育过夜，PBS清洗后避光滴加异硫氰酸荧光素(FITC)及罗丹明(rhodamine)标记的荧光二抗，37℃孵育30分钟，避光PBS清洗，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，sigma)进行复染细胞核，37℃30分钟。激光扫描共聚焦显微镜观察荧光信号。　　 3、Western blot　　 将含50μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，鼠抗人单克隆抗TRAF2、TRAF4、p70S6K、p-p70S6K(Thr389)、S6、β-actin抗体，兔抗人多克隆抗p-S6(Ser235/236)、NF-κB、LaminB1抗体，4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2小时后ECL显色。　　 4、免疫共沉淀　　 提取的蛋白中加入4μg的诱饵蛋白抗体，充分混匀后4℃孵育2小时后加入25μl Protein G Microbeads，混匀后继续4℃孵育1小时。按照操作说明步骤，混合液过μ柱，SDS上样缓冲液冲洗μ柱，收集免疫共沉淀产物。　　 5、核浆蛋白分离　　 按照Pierce公司说明操作，取10×106的细胞，依次加入体积比为200∶11∶100的试剂CERⅠ，CERⅡ和NER，分别提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白。检测β-actin和Lamin B1蛋白在两种细胞中的表达以验证核浆蛋白分离效果。　　 6、转染　　 siRNA-TRAF2及siRNA-TRAF4干扰序列，hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874（含有TRAF2全长基因的质粒）、pcDNA3-TRAF4（含有TRAF4全长基因的质粒）、pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF（TRAF结构缺失的TRAF4质粒），分别使用HiPerFect、Attractene质粒转染试剂转染至乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中，空质粒及乱序小RNA作为阴性对照。通过Western Blot鉴定转染效果。　　 7、四甲基偶氮唑盐(tetrazolium，MTT)法检测细胞增殖能力　　 处于对数生长期的乳腺癌细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液（细胞密度3×105个/ml），分别接种于4个96孔板培养板，每板分4组:空白组，未处理组、干扰对照组/空质粒对照组、干扰TRAF4组/转染pcDNA3-TRAF4质粒组/转染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF质粒组。培养第24、48、72、96小时后分别加入MTT(5mg/ml)20μl，继续孵育4小时后，每孔加入150μlDMSO溶解结晶，选择波长550nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。实验重复3次。绘制细胞生长曲线。　　 8、流式细胞仪检测细胞周期　　 细胞培养48小时后，将对照组与实验组细胞用胰酶消化，PBS洗涤细胞2次，离心收集细胞沉淀后用75％预冷酒精固定，4℃C过夜。取1×106细胞离心(1500rpm，5 min)，用50μg/ml PI重悬细胞，避光孵育45分钟。不同细胞周期内细胞所占百分比应用FACSCalibur流式细胞仪3.0软件检测。　　 9、流式细胞仪检测细胞凋亡　　 处于对数生长期的乳腺癌细胞用不含EDTA的胰酶消化，细胞离心(1000rpm，5min)，用PBS洗涤细胞2次(1000rpm，5min)，收集1-5×105细胞，加入500μl BindingBuffer悬浮细胞，避光加入AnnexinⅤ5μL混匀后，在加入Propidium Iodide5μL混匀，室温避光10分钟，FACSCalibur流式细胞仪检测不同细胞周期的细胞数。　　 10、统计分析　　 各组资料利用SPSS for Window13.0进行统计分析。p＜0.05有统计学意义。　　 结果：　　 1、TRAF4在乳腺癌细胞中的表达及定位　　 Western Blot结果显示， TRAF4蛋白可表达于正常乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231中。在正常乳腺上皮细胞MCF-10A中可见TRAF4蛋白较弱表达，而在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中它们的表达明显增强(p=0.001，p=0.000)。　　 通过免疫细胞荧光染色实验，我们证明了TRAF4在乳腺癌细胞中的定位情况。结果显示，TRAF4在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的细胞浆及细胞核中均有表达。Western Blot结果与免疫细胞荧光一致，并且同时发现，TRAF4在正常乳腺上皮细胞MCF-10A胞浆中的表达显著低于乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231(p=0.006，p=0.000)。而在正常乳腺上皮细胞MCF-10A胞核中的表达显著高于乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231(p=0.004，p=0.000)。　　 2、调节TRAF4的核、浆表达可影响乳腺癌细胞的物学行为　　 转染siRNA-TRAF4下调TRAF4在乳腺癌细胞MCF-7中的表达后，MTT法证实MCF-7细胞增殖能力显著下降(p=0.02);免疫印记方法检测TNF-α诱导下，细胞核内NF-κB表达显著下调(p=0.002)，p70S6K及S6蛋白磷酸化水平亦显著下调(p=0.003，p=0.002)，流式细胞仪检测早期凋亡细胞数显著增加(p=0.000)，细胞周期中S期细胞数显著减少(p=0.04)，G1期细胞显著增多(p=0.009)。　　 在乳腺癌细胞MCF-7中转染pcDNA3-TRAF4质粒（TRAF4全长质粒），免疫印记方法检测，发现TRAF4蛋白表达在细胞浆中显著上调(p=0.003)，细胞核中无明显改变(p＞0.05)。运用MTT方法检测乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖能力明显增加(p=0.02);免疫印记方法检测TNF-α诱导下，细胞核内NF-κB表达显著上调(p=0.002)，p70S6K及S6蛋白磷酸化水平亦显著上调(p=0.003，p=0.027)，且流式细胞仪检测MCF-7细胞周期中G1期细胞显著减少(p=0.009)，S期细胞显著增加(p=0.004)，早期凋亡细胞数明显减少(p=0.042)。　　 在乳腺癌细胞MCF-7中转染pcDNA3-TRAF4-DM-TRAF质粒（缺失TRAF结构域的TRAF4质粒），免疫印记方法检测，发现TRAF4蛋白表达在细胞核中显著上调(p=0.009)，细胞浆中无明显改变(p＞0.05)。运用MTT方法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖能力没有明显改变(p＞0.05);免疫印记方法检测TNF-α诱导下，细胞核内NF-κB表达没有明显变化(p＞0.05)，p70S6K及S6蛋白磷酸化水平亦显著上调(p=0.03，p=0.02)。流式细胞仪检测MCF-7细胞早期凋亡细胞数，没有明显变化(p＞0.05)，细胞周期中G1期细胞数显著减少(p=0.009)，S期细胞数显著增加(p=0.007)。　　 3、TRAF2与TRAF4蛋白在乳腺癌细胞中相互结合　　 通过免疫细胞荧光染色及免疫印记实验，我们证明了TRAF2及TRAF4在乳腺癌细胞浆中共表达。　　 通过免疫共沉淀方法，我们检测了在正常乳腺细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s中TRAF2和TRAF4的结合情况（免疫印记检测表明，这几种乳腺细胞中TRAF2和TRAF4均阳性表达），结果表明，在上述细胞中，均能够检测到TRAF2-TRAF4复合物。并且在细胞浆中TRAF2与TRAF4的结合量在正常乳腺细胞MCF-10A中显著低于乳腺癌细胞MCF-7(p=0.021)，MDA-MB-231(p=0.012), MDA-MB-435s(p=0.001)。　　 4、TRAF2调控TRAF4的核浆分布，从而影响乳腺癌生物学行为　　 在乳腺癌细胞MDA-MB-231中，应用siRNA-TRAF2干扰的方法使TRAF2的表达下调，通过免疫印记方法检测，我们发现TRAF4的细胞浆表达量显著下调(p=0.001)，而细胞核表达显著上调(p=0.001)。在乳腺癌细胞MCF-7中转染全长TRAF2质粒hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874使TRAF2表达上调后，TRAF4细胞核表达显著下调(p=0.001)，而细胞浆表达显著上调(p=0.011)。我们的结果显示在乳腺癌细胞中，TRAF2可以影响TRAF4的核、浆分布。　　 同时我们检测了上述干预条件对乳腺癌细胞生物学行为的影响。当干扰TRAF2表达，使TRAF4细胞浆表达下调，细胞核表达上调后，TNF-α诱导下运用免疫印记方法检测细胞核内NF-κB表达显著下调(p=0.008)，p70S6K及S6蛋白磷酸化水平亦显著下调(p=0.000，p=0.001)，且流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞早期凋亡细胞数明显增多(p=0.001)，细胞周期中G1期细胞数显著增加(p=0.022)，S期细胞数显著减少(p=0.04)。MTT检测细胞增殖能力显著下调(p=0.004)。　　 当转染全长TRAF2质粒hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874使TRAF2表达上调，使TRAF4细胞浆表达上调，细胞核表达下调后，TNF-α诱导下，运用免疫印记方法检测细胞核内NF-κB表达显著上调(p=0.003)，p70S6K及S6蛋白磷酸化水平亦显著上调(p=0.001，p=0.002)，且流式细胞仪检测MCF-7细胞周期中细胞周期中G1期细胞数显著减少(p=0.000)，S期细胞显著增加(p=0.000)，早期凋亡细胞数明显减少(p=0.004)。MTT检测细胞增殖能力显著上调(p=0.001)。　　 运用共转染的方法，将全长TRAF2质粒hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874及siRNA-TRAF4共转染入乳腺癌细胞MCF-7，使TRAF2高表达，TRAF4表达沉默后，应用免疫印记方法验证转染效率，检测上述乳腺癌生物学功能改变。与单纯转染TRAF2质粒相比，检测TNF-α诱导下，免疫印记方法检测细胞核内NF-κB表达显著下调(p＜0.05)，早期细胞凋亡数明显增加(p=0.002)。p70S6K及S6蛋白磷酸化水平亦显著下调(p=0.006，p=0.002)，且流式细胞仪检测MCF-7细胞周期中细胞周期中G1期细胞数显著增加(p=0.002)，S期细胞显著减少(p=0.006)。MTT检测细胞增殖能力显著下调(p=0.02)。　　 结论：　　 1、TRAF4蛋白在乳腺癌细胞中高表达，且与正常乳腺细胞相比，核表达显著减少，浆表达显著增强。　　 2、TRAF4浆蛋白及核蛋白在调节乳腺癌细胞生物学功能方面发挥不同作用:　　 上调TRAF4的浆表达使乳腺癌的增殖能力显著上调，可促进NF-κB激活从而抑制TNF-α诱导的凋亡。上调TRAF4细胞核表达及浆表达均可促进p70S6K磷酸化从而促进蛋白质合成，其具体机制还有待进一步探讨。　　 3、TRAF2与TRAF4可以在乳腺癌细胞中相互作用，TRAF2可以调节TRAF4的核转位，从而影响乳腺癌细胞生物学功能。　　 4、在乳腺癌细胞中，TRAF2可能介导TRAF2与TNFR之间的相互作用。