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目的:1、观察肝癌中细胞焦亡和内质网应激相关蛋白的表达情况,了解肝癌中内质网应激与细胞焦亡的相互作用关联。2、通过调控内质网应激发生改变,检测相关蛋白表达情况,进一步证实内质网应激在肝癌中对细胞焦亡具有调控作用。方法:在获得西南医科大学伦理委员会批准及所有患者知情同意情况下,本研究将选取我院既往收治的原发性肝细胞癌患者47例,并分别收集手术切除的人体肝癌组织及其相应的癌旁组织;同时我们还收集了我院15例肝血管瘤患者(具有手术指征)行手术切除时血管瘤周围正常肝脏组织作为实验正常对照组。各组肝脏组织行HE染色,在光镜下观察各组肝脏组织病理变化情况,证实取材的准确性;采用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹方法(Western blot,WB)分析细胞焦亡相关蛋白分子caspase-1和促炎因子IL-1β,以及内置网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关蛋白GRP78、CHOP、ATF6、PERK和IRE1在人体正常肝脏组织、癌旁组织及癌组织中的表达情况;WB测得的条带图采用Quantity One 5.4软件系统分析其灰度值大小;培养人肝癌细胞系7402和人正常细胞系L02,再次验证caspase-1蛋白和IL-1β以及ERS相关蛋白GRP78、CHOP、ATF6、PERK、IRE1在肝癌细胞和正常细胞中的表达情况;培养人肝癌细胞系7402,用浓度为3u M的ERS激动剂衣霉素(tunicamycin,TM)和100u M的ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)单独刺激肝癌细胞,共培养24小时后收集样品,采用WB分析细胞焦亡相关蛋白caspase-1,促炎因子IL-1β,以及ERS相关蛋白GRP78、CHOP、ATF6、PERK和IRE1在人肝癌细胞系7402的表达情况,了解药物干预后上述蛋白的变化趋势,分析肝癌细胞中ERS与细胞焦亡可能存在的相关调控机制。结果:(1)人肝癌组织和人肝癌细胞系7402中caspase-1和IL-1β均呈高表达状态:HE染色光镜下观察各组织病理特点,证实取材组织为理想部位;与正常肝组织及癌旁组织比较,WB测得肝癌组织中caspase-1蛋白和促炎因子IL-1β的表达量处于显著高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.001),癌旁组织较正常组织表达量也有所增加,差异具有统计学意义(P<0.001);IHC进一步分析肝癌组织中caspase-1蛋白变化情况,结果表明与正常组织及癌旁组织相比,caspase-1在肝癌组织处于高表达状态,呈棕黄色颗粒定位于细胞胞浆中;体外实验证实在肝癌细胞系7402中caspase-1蛋白和促炎因子IL-1β表达水平也显著高于正常细胞系L02(P<0.001)。(2)人肝癌组织和人肝癌细胞系7402中ERS相关通路蛋白呈活化状态:WB结果表明ERS相关蛋白GRP78、CHOP、ATF6、PERK以及IRE1在肝癌组织和肝癌细胞中呈过度活化状态,表达水平显著高于正常肝脏组织及癌旁组织(P<0.001);IHC进一步对ERS相关蛋白GRP78、CHOP、ATF6、PERK以及IRE1进行检验,检测结果发现ERS相关蛋白呈棕黄色染粒高表达于肝癌组织胞浆中,极少量蛋白移位到细胞核表达。(3)TM能够诱导肝癌细胞ERS进一步活化,并促进焦亡蛋白caspase-1和促炎因子IL-1β表达上调:在体外实验中,浓度为3u M的TM与肝癌细胞共培养24小时,并通过WB分析收集的样品发现,TM组ERS标志蛋白GRP78和CHOP蛋白表达较对照组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001),细胞焦亡相关蛋白caspase-1表达水平以及焦亡相关促炎因子IL-1β也较对照组明显升高(P<0.001)。(4)TUDCA能够抑制肝癌细胞7402中的ERS的活化和焦亡相关蛋白表达下调:使用浓度为100u M的TUDCA与肝癌细胞共培养24小时,WB检测发现ERS标志蛋白GRP78和CHOP蛋白的表达下调,同时细胞焦亡蛋白caspase-1和炎症反应因子IL-1β的表达也明显下调,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论:(1)在肝癌中细胞焦亡相关蛋白caspase-1、焦亡相关促炎因子IL-1β呈高表达状态,ERS相关蛋白呈活化状态。(2)ERS激动剂TM能够进一步刺激肝癌中ERS相关蛋白的活化,促进ERS相关蛋白GRP78、CHOP、ATF6、PERK以及IRE1蛋白的表达,启动未折叠蛋白反应(UPR),同时经TM处理的肝癌细胞中焦亡蛋白caspase-1和IL-1β表达进一步增加;(3)ERS抑制剂TUDCA能够抑制肝癌细胞中ERS的活化,下调ERS相关蛋白GRP78、CHOP、ATF6、PERK以及IRE1的表达,并下调细胞焦亡相关蛋白caspase-1以及促炎因子IL-1β的表达。这表明肝癌中确实存在一种新的细胞程序性死亡方式即细胞焦亡,同时细胞焦亡蛋白与ERS相关蛋白变化保持同步状态,在肝癌中ERS对细胞焦亡可能具有潜在的调控作用,这为进一步明确肝癌细胞死亡方式、探索肝癌的治疗提供了新的策略。