慢性咳嗽是内科门诊最常见的症状之一，常见病因包括嗜酸粒细胞性支气管炎、咳嗽变异性哮喘、胃食道反流性咳嗽、上气道咳嗽综合征等，慢性咳嗽病因诊断明确后，大部分患者均得到有效的治疗，但仍有部分病人经过系列全面的检查后，未能发现异常，病因不能明确，咳嗽持续存在，既往称为慢性特发性咳嗽、不明原因慢性咳嗽、难治性咳嗽等，这部分患者病因不明，咳嗽敏感性增高是共同特征，组织病理、气道炎症等均无特异性，也无特异性标记物。　　咳嗽敏感性增高是慢性咳嗽患者的主要特征之一，表现为对油烟、刺激性气味、冷空气等异常敏感，但化学性咳嗽敏感性（如辣椒素、柠檬酸等）检测仅部分患者阳性，可能存在其他诱发咳嗽的途径。　　近年发现，瞬时受体电位阳离子通道(transient receptor potential canonical channels，TRP)家族成员瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid1，TRPV1)（辣椒素受体）参与了慢性咳嗽的发生机制，慢性咳嗽患者气道TRPV1表达增加，并与辣椒素咳嗽敏感性相关。　　瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin1，TRPA1）是TRP家族另一成员，常常与TRPV1共同表达于迷走神经纤维，吸入选择性TRPA1激动剂肉桂醛、异硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC)等引起豚鼠和健康志愿者咳嗽， TRPA1可能也参与了慢性咳嗽的发生机制。　　通常认为咳嗽感受器在咽喉部、气管隆突分布最多，敏感性最高，临床上慢性咳嗽患者常表现为胸外气道和咽喉对局部刺激咳嗽敏感性增强，合并咽喉炎样症状，如咽喉或咽喉下发痒、异物感、频繁清喉等，可因说话唱歌、冷空气、烟雾等诱发咳嗽。　　最初的研究认为TRP在神经节及神经纤维上表达，TRPA1的研究也主要针对神经组织或神经元进行，随着研究的深入，许多非神经组织、细胞也有TRPA1的表达，如肺部以及支气管上皮细胞、平滑肌细胞等，TRPA1在这些非神经细胞上的功能尚不清楚。　　香烟烟雾可以引起咳嗽等呼吸道症状，香烟烟雾及其主要成分丁烯醛、丙烯醛可以激动辣椒素敏感的神经元，这种反应可以被TRPA1拮抗剂HC030031抑制，但不受TRPV1拮抗剂辣椒平影响。人与啮齿类的TRPA1功能不完全相同，烟雾能否激活人TRPA1，长期烟雾暴露对TRPA1的功能有无影响，目前尚不明确。　　因此，本研究拟探讨TRPA1介导的化学性刺激咳嗽激发试验方法，观察慢性咳嗽患者TRPA1介导的咳嗽敏感性变化以及与TRPV1介导的咳嗽敏感性之间的关系；并观察慢性咳嗽患者气道不同部位黏膜TRPA1的表达情况；在体外实验部分，检测香烟浓集物CSC刺激后气道上皮细胞TRPA1mRNA及蛋白的表达，以及检测香烟刺激后TRPA1-HEK293细胞内钙离子浓度变化，了解CSC对TRPA1表达及功能的影响。　　第一部分慢性咳嗽患者TRPA1介导咳嗽敏感性检测及与TRPV1介导咳嗽敏感性的关系　　研究目的　　探讨TRPA1介导的异硫氰酸烯丙酯（AITC）咳嗽激发试验方法，观察慢性咳嗽患者TRPA1化学刺激咳嗽敏感性的变化以及与TRPV1介导的辣椒素（CAP）咳嗽敏感性之间的关系。　　研究对象　　慢性咳嗽患者81例及29例健康志愿者。　　研究方法　　1.慢性咳嗽患者根据年龄分为青年组（<45岁），中老年组（≥45岁）。　　2.受试者入选后先进行AITC咳嗽激发，间隔2~3天后进行辣椒素咳嗽激发试验。　　3.咳嗽激发试验：采用定量吸入法，激发液浓度逐渐递增，AITC激发液分别为31.3，62.5，125，250，375，500，750，1000mmol/L；CAP激发液浓度：1．95~1000μmol/L。当吸入激发液后30秒内出现5次或5次以上咳嗽，终止试验，分别记录出现2、5次咳嗽的浓度即C2、C5，结果以C2、C5的对数即LgC2、LgC5表示。　　结果　　1.慢性咳嗽患者青年组及中老年组两组临床特征无显著性差异。　　2.慢性咳嗽组、正常对照组的 AITC5次咳嗽成功激发率分别是92.60％、93.10%。　　3.不良事件： AITC激发不良事件发生率7.27%，表现为激发时咳嗽剧烈、胸闷（2.72%），其中2例休息好转，另1例喉部出现喘鸣音，经吸入万托林200μg好转；恶心（3.63%），头晕（0.09%），停止激发后自行好转。　　4.慢性咳嗽组AITC LgC5较健康对照组低[2.57(0.60)vs2.70(0.30)]，差异有显著性 p<0.05), AITC LgC2两组之间差异无显著性[2.40(1.05) vs2.40(0.60)]（p>0.05）。慢性咳嗽组CAP LgC2，LgC5较正常对照组低，1.04(1.50)vs1.89(1.51)，1.94(1.50)vs3.00(0.38)，差异有显著性p<0.05。　　5.青年组、中老年组 AITC LgC2、 LgC5均无显著性差异，[2.40(0.98)vs2.40(0.90)，2.57（0.6）vs2.57（0.60）]，CAP LgC2、LgC5均无显著性差异0.89(1.50)vs1.19(1.50)，1.79(1.50)vs2.09(1.35)，（p>0.05）。　　6.女性慢性咳嗽患者的AITC LgC2及LgC5低于男性患者[0.44(0.30) vs1.04(1.95),1.64(1.35) vs2.69(0.99)]，p<0.05)；女性患者CAP LgC2较男性患者显著性降低，[0.44(1.20)vs1.34(1.88)]，p<0.05。　　7. AITC LgC2与CAP LgC2的相关系数为0.069， AITC LgC5与CAP LgC5的相关系数为0.065，相关性均无统计学意义（p>0.05)。　　8.本组同时完成AITC及CAP咳嗽敏感性检测的66例慢性咳嗽患者中，AITC与CAP咳嗽敏感性增高的阳性率是分别是42.43%、57.58%，联合两种检测方法，咳嗽敏感性增高的慢性咳嗽患者达74.25%。　　结论　　1.慢性咳嗽患者AITC咳嗽敏感性增高。　　2. AITC咳嗽敏感性与CAP敏感性不相关，AITC咳嗽激发试验可作为辣椒素咳嗽激发试验的一个补充。　　第二部分慢性咳嗽患者气道黏膜TRPA1的表达　　研究目的　　了解慢性咳嗽患者TRPA1在气道不同部位黏膜的表达。　　研究方法　　1.收集慢性咳嗽患者气道不同部位（咽、气管上段、隆突、右上叶支气管）黏膜活检组织。　　2.免疫荧光法检测气道黏膜TRPA1的表达。　　3.图像分析软件Image-Pro Plus6.0分析气道黏膜组织TRPA1，计算每张切片的平均荧光强度（总荧光强度/总面积）。　　结果　　1.入选健康对照组9例，男5例，女4例；慢性咳嗽患者33例，男20例，女13例，两组年龄无显著性差异；共收集慢性咳嗽组咽后壁黏膜15份，气管上段黏膜17份，隆突黏膜19份，右上叶支气管黏膜25份；正常对照组气道部位隆突黏膜3份，右上叶支气管黏膜9份。　　2. TRPA1表达定位于气道上皮及上皮下间质、血管壁、平滑肌、部分炎症细胞等，主要是在胞膜上表达，部分胞浆也有表达。　　3.慢性咳嗽患者平均气道黏膜TRPA1荧光强度0.062（0.126）高于正常对照组0.008（0.023），差异有显著性，p<0.05。　　4.慢性咳嗽组气道各部位黏膜TRPA1的平均荧光强度差异无显著性，p>0.05。　　5.辣椒素高敏组慢性咳嗽患者气道黏膜 TRPA1的荧光强度[0.081（0.117）]高于常敏组[0.034（0.110）]及正常对照组[0.011（0.011）]，常敏组[0.034（0.110）]亦高于正常对照组[0.011（0.011）]，差异均有显著性，p<0.05。　　6.男性及女性慢性咳嗽患者气道TRPA1的平均荧光强度分别为0.047（0.110），0.057（0.096），差异无显著性，p>0.05。　　7.病因明确组与不明原因组气道不同部位 TRPA1的表达无显著性差异,[0.052(0.057) vs0.072(0.073)], p>0.05。　　8.慢性咳嗽患者气道TRPA1的平均荧光强度与辣椒素咳嗽阈值及AITC咳嗽阈值(LgC2,LgC5)的相关性均无统计学意义。　　结论　　1.慢性咳嗽患者气道黏膜TRPA1的表达升高。　　2.除TRPV1外，TRPA1可能也参与了慢性咳嗽的发生机制。　　第三部分香烟浓集物对TRPA1表达及功能的影响　　分题1：香烟浓集物对人支气管上皮细胞TRPA1/TRPV1 mRNA及蛋白表达的影响　　研究目的　　了解香烟浓集物对人支气管上皮细胞TRPA1/TRPV1 mRNA表达的影响。　　研究方法　　1.不同浓度香烟浓集物（CSC）刺激人支气管上皮细胞（16HBE）24，48小时后，荧光定量PCR法及蛋白免疫印迹法分别检测TRPA1/TRPV1 mRNA及蛋白的表达量。　　2.荧光定量PCR法观察TRPA1拮抗剂HC030031对CSC刺激16HBE后TRPV1 mRNA表达的影响。　　结果　　1.与阴性对照（未刺激细胞组）比较，CSC100μg/ml刺激16HBE24小时后TRPA1 mRNA表达显著升高。　　2.与阴性对照（未刺激细胞组）比较，不同浓度 CSC刺激16HBE48小时后TRPA1 mRNA表达显著升高。　　3. CSC刺激16HBE24及48小时后TRPV1 mRNA表达无显著变化。　　4.拮抗剂HC030031与CSC共同刺激16HBE24或48小时后，TRPA1 mRNA表达无显著变化，　　5. CSC刺激16HBE细胞24及48小时后，对细胞TRPA1及TRPV1的蛋白表达均无影响。　　结论　　1. CSC可以使气道上皮细胞 TRPA1mRNA表达增加，但 TRPA1拮抗剂HC030031对该效应无抑制作用。　　2. CSC对气道上皮细胞TRPV1mRNA的表达无影响。　　3. CSC对TRPA1、TRPV1蛋白表达无明显影响。　　分题2香烟浓集物对人TRPA1通道功能的影响　　研究目的　　通过检测香烟浓集物(CSC)刺激转染人TRPA1的HEK293(TRPA1-HEK293)细胞后细胞内钙离子浓度，观察较长时间CSC暴露对TRPA1通道的作用。　　研究方法　　1. CSC分别与细胞孵育24或48小时。　　2. Fura-2-AM标记测量细胞内钙离子法测量细胞的基础钙及外源性细胞钙内流,拮抗剂HC030031在检测前30分钟加入　　结果　　1. CSC刺激24小时，CSC可使稳定转染TRPA1的HEK293（TRPA1-HEK293）细胞基础钙及外源性细胞钙内流增加，并呈浓度依赖性，在未转染的HEK293细胞未见此现象。　　2. CSC刺激48小时后，浓度依赖性地使TRPA1-HEK293细胞基础钙及外源性细胞钙内流增加。　　3. CSC100μg/ml刺激 TRPA1-HEK293细胞24小时后，加入不同浓度的HC030031，30分钟后检测细胞内钙离子浓度，发现，HC030031对 CSC引发的细胞钙内流有抑制作用。　　结论　　CSC可以使TRPA1-HEK293细胞内钙离子浓度及外源性细胞钙内流增加，其作用机制可能主要是通过激活膜上受体操纵性钙通道TRPA1。