论文部分内容阅读
池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)原产自日本,蚌科、帆蚌属,是一种新型优质的淡水育珠蚌类。但由于近年来养殖规模的扩大、养殖环境的破坏,池蝶蚌病害问题频繁发生,并给其养殖造成了重大的经济损失。本实验从池蝶蚌转录组数据中获得的C型凝集素(C-type lectin)部分片段,借助于RACE PCR反应、Real-time PCR和原核表达等技术克隆出该基因全长并对其表达情况进行了相关分析,为进一步研究池蝶蚌的免疫机制提供了基础。1、根据本实验室的转录组数据,运用RACE PCR的方法首次扩增出池蝶蚌C型凝集素全长cDNA,池蝶蚌C型凝集素的cDNA全长为1716bp,其中5’非翻译区(5’UTR)为92bp,3’非翻译区(3’UTR)为898bp,包括一个726bp的开放阅读框,编码241个氨基酸。2、Real-time PCR检测C型凝集素基因在各组织中的表达情况,结果得出它在肝胰腺、血淋巴、外套膜、鳃、闭壳肌以及性腺中都有表达,其中在血淋巴中的表达量最高,其次为外套膜、肝胰腺、鳃和闭壳肌,在性腺中表达量最低。3、利用荧光定量PCR技术对LPS刺激后C型凝集素在血淋巴、肝胰腺和性腺中的表达情况进行检测,结果发现,在肝胰腺中,C型凝集素在刺激后24h左右的表达量最高,是对照组的1.72倍,其在血淋巴中的表达量最高值出现在72h,是对照组的1.39倍,而C型凝集素在性腺中的表达峰出现在48h,表达量是对照组的3.40倍。4、通过双酶切连接反应,构建pGEX-4T-1-CLEC原核表达载体,并将其转化到Rosetta表达菌中,在0.5mM IPTG的诱导下成功表达出融合蛋白。由于融合蛋白以包涵体形式存在,包涵体通过变性、复性后,最后利用Glutathione Sepharose4B纯化出目的蛋白。