背景我国心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的患病人数高达2.9亿,死亡率居于首位,已成为重大的公共卫生问题,给国民经济带来沉重的负担。因此,寻找新的治疗靶点和干预措施来防治心血管疾病刻不容缓。生活方式和膳食模式的改变是近年来我国CVD发病率升高的重要原因。其中,由高脂膳食(high-fat diet,HFD)引起的血脂异常、肥胖、代谢紊乱等均是CVD的重要危险因素。当摄入的脂肪超过肝脏的代谢负荷后,可诱发血脂代谢紊乱,从而造成血管内皮细胞氧化应激损伤,并进展为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),后者是CVD的病理基础。而AS进一步发展可产生冠状动脉堵塞,从而造成心肌细胞不可逆损伤甚至死亡。因此,通过膳食途径对代谢性疾病进行干预是一种经济且有效的手段。其中,白藜芦醇(resveratrol,RSV)是一种广泛存在于植物性食物中的多酚类植物化学物,可通过抗氧化应激、抗炎等作用有效改善CVD,但其中的机制尚未阐明。肝脏是脂肪代谢的核心器官,有脂肪蓄积引起的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是CVD的一项独立危险因素。本课题组前期研究提示RSV可通过蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)介导的通路改善HFD引起的多种代谢性疾病,因此,PKA可能成为RSV防治代谢性CVD的重要靶点。多项体外研究表明PKA密切参与到肝脏脂肪代谢调节中,然而,由于PKA的亚基种类较多,难以建立PKA完全敲除的动物模型,因而关于PKA对肝脏脂肪代谢的体内研究尚缺乏直接证据。此外,HFD引起的血管内皮细胞氧化应激是AS发生发展的关键因素,而血管内皮细胞线粒体动力学与细胞氧化还原稳态关系密切。我们前期发现RSV可以调节内皮细胞的氧化还原稳态,但RSV在调节内皮细胞线粒体动力学过程中的作用靶点仍有待研究。防治CVD的另一个重要方面是提高心肌细胞在病理性应激情况的存活能力。既往的研究提示在成年心室肌细胞中,单核心室肌细胞(mononucleated ventricular myocytes,MVMs)比双核心室肌细胞(binucleated ventricular myocytes,BVMs)分化程度更低,且具有一定的增殖潜力,因而受到广泛的关注。但受限于研究方法,MVMs与BVMs在基因层面的特征及对病理刺激因子的反应性一直未能得到全面的揭示。深入研究两种心肌细胞的差异对于理解心肌细胞的生理学特征、提高心肌细胞在病理条件下的存活率具有重要的意义。目的1.建立肝脏特异性PKA活性抑制性小鼠模型,研究PKA在体内对HFD的代谢反应及转录组变化,为PKA在脂肪代谢中的作用提供有效的体内研究模型,并探索PKA作为代谢性CVD防治靶点的潜力。2.阐明RSV在调节内皮细胞线粒体动力学和抗氧化应激中的作用及机制,为代谢性CVD的防治提供膳食营养干预策略。3.揭示MVM和BVM在基础状态下和受压状态下的转录组特征,并从转录组差异提示的结果出发深入研究MVM和BVM的病理生理学基础,及RSV分别对两种细胞在受压条件下的存活情况和抗氧化应激损伤的效应,完善RSV保护心肌细胞的作用和机制。方法1.利用转基因技术构建过表达“loxP-PKA抑制肽-绿色荧光蛋白(PKAi-GFP)-loxP”基因的小鼠,通过与Alb-cre工具鼠交配后得到在肝脏特异性过表达PKAi-GFP小鼠模型(PKAi小鼠),并用蛋白免疫印记方法验证肝脏组织中PKAi-GFP表达,用RT-qPCR检测多种组织中PKAi-GFP的表达水平,用PKA活性检测试剂盒检测PKAi肝脏组织中PKA活性被抑制程度。分别研究普通饮食(chow diet,CD)和HFD诱导下PKAi小鼠与同窝对照小鼠的体重、肝脏指数、肝脏内甘油三酯的含量,通过H&E染色观察肝脏组织病理学变化,油红O染色观察肝脏组织中脂滴聚集,并通过第二代RNA测序技术揭示转录组变化及生物信息学方法预测PKA在HFD刺激下改变的通路。2.利用棕榈酸(palmitic acid,PA)处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)建立氧化应激模型,通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit8,CCK8)检测细胞活力并确定最适建模浓度和时间。利用流式细胞术和酶标仪检测DCFH-DA探针标记的细胞内ROS,用脂质过氧化和超氧化物歧化酶检测试剂盒检测RSV干预后HUVEC内氧化应激变化;用流式细胞术和酶标仪检测JC-1探针标记的线粒体膜电位;共聚焦显微镜和电子镜显微镜观察线粒体形态变化;利用蛋白印迹检测线粒体融合蛋白的表达;利用siRNA分别敲降TyrRS和PARP1后,检测TyrRS-PARP1通路在RSV调节线粒体动力学、氧化应激中的作用。3.通过RNA模板5’末端的转换机制测序技术(switching mechanism at 5’end of RNA template-sequencing,SMART-seq)检测基础状态下和异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)刺激下的MVM与BVM转录组,并利用生物信息学技术分析两者的差异性特征;利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)技术检测MVM和BVM在基础状态和ISO刺激下的凋亡率;分别利用JC-1、DCFH-DA标记线粒体膜电位和细胞内ROS,激光共聚焦显微镜检测并分析MVM和BVM在基础状态和ISO刺激下荧光强度;利用DCFH-DA标记细胞内活性氧、Rhod-2标记线粒体钙,在共聚焦显微镜时间扫描模式下检测ISO刺激后MVM和BVM线粒体钙和ROS的变化。RSV预处理心肌细胞后,用台盼蓝标记死细胞,分别检测MVM和BVM的死亡率,共聚焦显微镜检测DCFH-DA标记的细胞内ROS。结果1.抑制肝脏内PKA活性可促进HFD诱导的肝脏内甘油三酯蓄积。1.1通过loxP/cre系统建立了肝脏内条件性PKA活性抑制小鼠模型(PKAi小鼠),其肝脏中特异性表达有PKAi-GFP,且抑制了PKA 61%的活性。1.2小鼠肝脏中PKA活性被抑制后,在普通饮食喂养下,体重、肝脏指数、肝脏内甘油三酯的含量与对照小鼠无差异;而在HFD诱导8周后,与对照组比较:PKAi小鼠肝脏指数增加、肝脏内出现更严重的脂肪蓄积。1.3转录组研究显示:在基础饮食下,PKAi和对照小鼠差异表达基因富集分析提示PKA主要参与到了脂肪代谢。而两种小鼠在HFD诱导后:PKAi小鼠主要发生热休克蛋白相关的应激反应相关通路,而对照小鼠则主要体现在免疫系统应答的改变。2.RSV通过激活TyrRS-PARP1通路抗PA诱导的内皮细胞氧化应激。2.1 HUVEC在200μM PA处理24h后,细胞活力下降至对照组的47%,该处理方案用于该研究中建立HUVEC氧化应激模型。在该模型中,细胞活力下降,细胞内ROS升高、脂质过氧化产物增多、超氧化物歧化酶活性下降;而RSV可以抑制以上变化。2.2在HUVEC氧化应激模型中,线粒体膜电位下降,线粒体成碎片化形态,且线粒体融合相关蛋白(OPA1,MFN1和MFN2)表达下降,而RSV处理可减少线粒体碎片化程度,上调融合相关蛋白;但当TyrRS、PARP1被抑制后,RSV对线粒体膜电位、形态学及融合相关蛋白的调节作用消失。3.RSV通过减轻ISO诱导的BVM氧化应激降低心肌细胞死亡率。3.1 MVM和BVM基础状态下的转录组有显著的差异,其中MVM中高表达的基因主要集中在RNA合成、抗凋亡方面,而BVM中高表达的基因则主要集中在蛋白质分解和P53介导的凋亡通路。3.2在添加ISO作为病理刺激的情况下,BVM比MVM更容易发生凋亡,其机制与BVM比MVM在ISO刺激后产生的ROS更多、维持线粒体膜电位能力更弱、发生线粒体钙超载速度更快有关。RSV的干预可以通过抑制BVM中ROS的产生而增加BVM的存活率,但对MVM的ROS及存活率没有显著影响。3.3 ISO诱导后的MVM和BVM转录组变化也存在显著差异。MVM在ISO刺激后倾向于发生自噬、减少细胞内的合成类的代谢活动从而降低细胞功能;而ISO刺激后的BVM则倾向于发生合成代谢来代偿性使细胞的功能活跃。结论1.成功建立并验证了一种全新的基于loxP/cre系统的肝脏特异性PKA活性抑制转基因小鼠模型,该小鼠肝脏的转录组发生显著改变,且在HFD喂养后较快出现肝脏内甘油三酯的蓄积。2.RSV可以通过激活TyrRS-PARP1通路调节内皮细胞线粒体动力学变化,从而改善PA诱导的氧化应激损伤。3.MVM和BVM是在转录组层面和生理功能层面具有显著差异的两种心肌细胞亚群。在病理刺激下,MVM比BVM更易存活,两种细胞应对病理性刺激的反应方式不同,而RSV的干预可以通过减轻BVM氧化应激而提高其存活率。综上,本研究探索了膳食营养干预防治代谢性CVD的作用和新机制。RSV是代谢性心血管疾病的保护性因子,对其作用机理的揭示为防治CVD提供了新思路。