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目的:建立基于孕酮的精子优选方法并且研究相关调节机制。方法:设计制作了一种模拟人类女性生殖系统的长距离通道装置,用不同的孕酮浓度及其位置制备精子优选条件,并通过检测不同时间点不同位置处的精子浓度加以验证。用Diff-quik染色、染色质扩散法和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶染色法分别检测精子优选前后的形态、DNA片段和凋亡状态,评价所建立方法的效果。用热休克蛋白90(Hsp90)特异性抑制剂格尔德霉素处理孕酮诱导的人精子,然后分别经金霉素染色评价获能、计算机辅助精子分析仪(CASA)分析运动参数和超激活运动百分率。用间接免疫荧光染色分别检测Hsp90与细胞分裂周期蛋白Cdc37(Cdc37)、内皮型一氧化碳合酶(eNOS)共定位情况;通过免疫共沉淀技术证明Hsp90与其共伴侣Cdc37的相互作用。用免疫印迹方法分析Hsp90在人精子获能期间表达情况以及格尔德霉素处理对其影响;分析蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89和蛋白激酶C(PKC)抑制剂Go6983在精子获能期间对Hsp90的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化影响,Hsp90抑制剂17-AAG对人精子酪氨酸蛋白激酶Src活性位点Y416的磷酸化影响,17-AAG和格尔德霉素对获能期间精子总蛋白苏氨酸磷酸化的影响。通过免疫沉淀检测Hsp90丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化。用酰基-生物素置换法检测精子总蛋白质棕榈酰化,通过CSS-Palm 4.0软件预测小鼠Hsp90棕榈酰化位点,并用免疫沉淀结合酰基置换反应检测精子获能期间的棕榈酰化。结果:确立了基于孕酮的精子优选方法实验条件,经建立的方法优选后,人精子形态正常和DNA完整的比例增加,凋亡状态没有显著变化。格尔德霉素以剂量依赖的方式抑制孕酮诱发的精子获能,降低孕酮诱发的精子VSL、VAP、STR、BCF及超激活运动比例。Hsp90分别与eNOS和共伴侣Cdc37存在共定位,且与共伴侣Cdc37存在蛋白相互作用。人精子获能期间的Hsp90表达水平增加并被格尔德霉素抑制。Hsp90丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化水平受H-89和Go6983抑制。17-AAG或格尔德霉素改变人精子获能期间的蛋白苏氨酸磷酸化,并且17-AAG抑制酪氨酸蛋白激酶S rc活性位点Y416的磷酸化。小鼠精子多种蛋白发生棕榈酰化。软件预测小鼠Hsp90共有5个位点;免疫沉淀结合酰基置换反应结果显示小鼠附睾头部和尾部精子Hsp90均发生棕榈酰化,附睾头部精子Hsp90棕榈酰化水平比附睾尾部精子弱,附睾尾部精子获能培养后,Hsp90棕榈酰化水平增加。结论:成功建立了基于孕酮的精子优选方法,可提高精子质量;孕酮调节精子功能受Hsp90介导;而Hsp90与共伴侣Cdc37发生相互作用,Hsp90在精子获能期间发生棕榈酰化、受PKA和PKC调节而发生丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化,调节Src活性。