低氧引起早期肺血管收缩反应和后期的肺血管结构改变是低氧性肺动脉高压（HPH）形成和发展的主要病理学特征。HPH发病机制复杂，至今仍不清楚。目前研究认为HPH发生机制与免疫炎症反应、氧化应激有关。以低氧为始发刺激因素，引起机体及肺组织产生大量的炎症相关因子和活性氧簇（ROS），造成肺血管内皮细胞损伤，使其内皮产生的收缩和扩张性血管因子失衡，引起血管收缩；与此同时炎症相关因子和ROS进入血管内，直接或间接造成肺血管壁重塑，形成肺动脉高压。目前基于抗炎与抗氧化应激治疗HPH，已取得一定的进展。以肺血管中膜层平滑肌细胞增多和肥大为特征的血管壁重塑，是HPH持续存在且难以治疗的重要因素，关于增多的平滑肌细胞来源也一直是研究的热点。内皮-间质转化（endothelial-mesenchymal transition, EnMT）是指内皮细胞在一些因素作用下，失去原有细胞极性和细胞之间连接，而转变成间质细胞形态和特征的过程。EnMT因参与胚胎期心脏瓣膜及血管形成而被人们所认识。近年来研究发现EnMT与血管性疾病发生密切相关。有研究证实体外培养的内皮细胞在炎症因子的刺激下可发生EnMT，那么增多的平滑肌细胞是否有经EnMT途径转化而来的，目前尚未见报道。氧化苦参碱是从豆科属植物苦参中提取出来的一种生物碱，具有抗炎、抗氧化应激作用，已成为临床治疗肿瘤、肝纤维化的一线用药。目前有研究发现氧化苦参碱能够抑制心室重构，在心血管病治疗中同样发挥重要作用，但氧化苦参碱能否抑制肺血管壁重构，有效防治HPH，目前尚未见相关报道。一、氧化苦参碱防治大鼠HPH的作用研究。1、实验目的从整体、血管和细胞三个水平，探讨氧化苦参碱对大鼠HPH的防治作用。2、实验方法整体和血管环实验：共分为八组，分别为：常氧组、低氧组、低氧+氧化苦参碱组、常氧+氧化苦参碱组，以上四组为28天，每组各设0天对照。在整体水平复制大鼠HPH模型，检测HPH参数，如导管法测肺动脉压，测量右心室肥厚指数比，肺组织切片进行α-SMA免疫组化观察肺血管中膜层厚度。分离各组大鼠肺动脉三级血管制备血管环，给予苯肾上腺素，观察各组血管的反应性。细胞实验：原代培养肺动脉平滑肌细胞（PASMCs），使用含1%O2培养箱培养48h。分为六组：常氧组、低氧组、低氧+不同浓度氧化苦参碱组（50,100,200μg/ml)组、常氧+200μg/ml氧化苦参碱组。MTT法检测细胞增殖。3、实验结果通过HPH参数证明HPH大鼠模型复制成功。低氧+氧化苦参碱组大鼠肺动脉压、右心室肥厚指数比较低氧组显著降低（P<0.05），小血管中膜层厚度也明显降低；低氧组血管环对缩血管物质苯肾上腺素的反应性较常氧组显著增高（P<0.05），低氧+氧化苦参碱组血管环对缩血管物质的反应性较低氧组明显降低（P<0.05）；低氧可引起PASMCs增殖，不同浓度的氧化苦参碱均能明显抑制低氧诱导的PASMCs增殖（P<0.05）。4、实验结论氧化苦参碱能抑制低氧性肺血管收缩和PASMCs增殖，改善低氧引起的血流动力学变化，减轻低氧性肺血管重建，有效防治大鼠HPH的发生发展。二、氧化苦参碱防治大鼠HPH的机制研究。1、实验目的探索氧化苦参碱是否通过抗炎症反应，激活细胞内抗氧化应激系统以及抑制EnMT途径防治HPH。2、实验方法抗炎作用：取各组大鼠肺组织标本，通过Real-time PCR法检测炎症相关因子，免疫组化法检测单核细胞/巨噬细胞表面抗原ED-1及T淋巴细胞表面抗原CD3，Western blotting法检测肺组织中活化的NF-κB表达。抗氧化应激作用：将PASMCs分为常氧组、低氧组、低氧+氧化苦参碱组、常氧+氧化苦参碱组。通过流式细胞仪检测细胞内ROS水平，酶标仪检测H2O2和GSH含量，Western blotting法检测Nrf2、HO-1和SOD-1蛋白表达。抑制EnMT作用：原代培养肺微血管内皮细胞（PMVECs）予1%O2处理5天，普通光镜观察细胞形态，透射电镜观察细胞超微结构，免疫荧光、Western blotting和Real-time PCR检测EnMT标志物，MTT法和划痕实验观察细胞功能。低氧同时给予200μg/ml氧化苦参碱，5天后光镜观察细胞形态，Western blotting、Real-time PCR检测EnMT标志物。构建HIF-1α低表达人脐静脉内皮细胞系（HUVECs），低氧同时给予氧化苦参碱，Western blotting和Real-time PCR检测EnMT标志物。3、实验结果1）细胞因子MCP-1、IL-6、SDF-1，粘附分子VCAM-1、ICAM-1，与细胞生长分化有关因子TGF-β、ET-1、VEGF，低氧后，上述8种炎症相关因子较常氧时明显增多（P<0.05)，低氧并给予氧化苦参碱可降低其表达（P<0.05)。氧化苦参碱可减少低氧引起的肺血管周围单核细胞/巨噬细胞和T细胞聚集，减轻肺小血管重塑，降低NF-κB的表达（P<0.05)。2）低氧组PASMCs细胞内ROS、H2O2含量较常氧组明显升高（P<0.05)，而抗氧化物GSH表达减少（P<0.05)。给予氧化苦参碱可显著降低胞内ROS和H2O2水平，升高GSH（P<0.05)。Western blotting结果显示低氧后Nrf2、HO-1和SOD-1较常氧组表达减少，而低氧并给予氧化苦参碱可逆转低氧对这三种蛋白的表达。3）低氧组PMVECs细胞形态变为间质细胞特征的长梭型，超微结构也具有间质细胞和中间转化的形态特征，并且表达EnMT标志物，并获得间质细胞增殖和迁移能力增强的功能，而常氧组未出现EnMT。低氧并给予氧化苦参碱能够逆转低氧诱导的EnMT，并抑制低氧引起的HIF-1α表达。si-HIF-1α的HUVECs与正常HUVECs在低氧条件下相比较，干扰组显著降低了EnMT。4、实验结论1）氧化苦参碱可以减少HPH大鼠肺血管周围单核细胞/巨噬细胞和T细胞聚集，降低肺组织炎症因子表达，抑制肺血管重塑，其机制与抑制NF-κB活化有关。2）氧化苦参碱可以降低PASMCs内ROS、H2O2含量，升高GSH水平，发挥抗氧化功效，其机制与激活细胞内源性抗氧化通路Nrf2/HO-1及Nrf2/SOD有关。3）首次发现低氧可诱导PMVECs发生EnMT，并证实氧化苦参碱可抑制低氧诱导的细胞EnMT，其机制与下调HIF-1α表达有关。