暴露于高温条件下,生物体普遍的反应是产生一组热激蛋白(HSP)。热激蛋白基因(hsp)表达调控包括选择性转录和选择性翻译,其中转录水平的调控是热激蛋白基因表达调控的主要方式。热激因子(HSF)与热激基因上游调控片段中的热激元件(HSE)结合来调节热激基因的转录。我们通过构建质粒文库的方法首次克隆了番茄线粒体小分子热激蛋白基因(Lehsp23.8)上游1915 bp的调控区,通过与gus基因融合,在转基因番茄中分析了其热诱导的组织特异性及发育性表达特征,详细分析了该启动子在不同发育时期番茄果实中的热诱导表达模式,并证明该启动子还受低温、外源ABA及重金属胁迫诱导。进而构建了一系列的突变载体(pK1915、pK1327、pK871、pK565、pK255、pK∞AT14、pK△AT15、pK△AT34、pK△AT12、pK*HSE),通过对各种胁迫下转基因烟草的GUS活性分析来研究该启动子的功能序列。主要实验结果如下:1.通过构建质粒文库的方法从番茄中克隆了Lehsp23.8上游1915 bp的调控区(AB239774)。该序列含有TATA box及CAAT box等启动子基本元件,还具有7组典型的HSE元件及多个AT-rich区,另外还有许多逆境反应元件,如ABRE,C-repeat_DRE,AP-1。凝胶阻滞结果表明,纯化的HsfA2蛋白与Lehsp23.8启动子的HSE元件在体外具有结合活性,且与近端5组HSE的结合活性比与远端HSE6的结合活性强。构建全长Lehsp23.8启动子(1915 bp)与gus基因的融合载体,转化番茄,Southern杂交结果表明gus基因以单拷贝或两个拷贝形式整合在转基因植株基因组中。常温条件下,转基因番茄中除个别组织中检测到GUS弱表达外,大部分组织中检测不到GUS表达。在Lehsp23.8启动子控制下,对转基因番茄中热诱导的发育性和组织特异性GUS表达进行了检测。热激之后,转基因番茄的根、叶、花、果及萌发的种子均检测到高水平的GUS表达。在花的不同组织部位中,Lehsp23.8启动子的热诱导活性随着花的发育而有所差异。番茄果实各个部位中热诱导的GUS酶活性是不同的。番茄果皮中GUS酶活性高于胎座中,而果浆中GUS酶活性最低。导致果皮中GUS酶活性最高的热激温度随果实发育阶段的不同而不同,绿果为42℃,白果为36℃,微红果和红果为39℃。在39℃长时间热激条件下,所有时期的果实都表现出高水平的GUS酶活性。而且GUS表达轮廓随番茄果实成熟度的不同而不同,随番茄果实的成熟,热激应答逐渐变弱。另外,在低温、外源ABA及重金属(Cd2+,Cu2+,Pb2+或Zn2+)胁迫下,转基因番茄叶片及幼根中均检测到明显的蓝色。低温及外源ABA处理条件下该启动子的活性不是很强,约为热激强度的四分之一。以上结果表明Lehsp23.8启动子是热诱导强启动子并受多种胁迫诱导。2.构建5’缺失Lehsp23.8启动子与gus基因的融合载体(pK1915、pK1327、pK871、pK565、pK255),转化烟草。对不同长度启动子转化株系在热激、低温、外源ABA及重金属Pb2+胁迫条件下的GUS荧光活性进行测定。全长Lehsp23.8启动子(1915 bp)转基因烟草的GUS组织化学染色结果表明,常温下检测不到GUS表达,而热激处理后,在转基因烟草幼苗的根、茎、叶及不同发育时期的花中均检测到强烈的GUS组织化学染色。GUS荧光分析结果表明565 bp启动子介导的GUS热诱导表达是最强的,而255 bp启动子片段驱动的GUS热诱导表达最弱,1915 bp、1327 bp、871 bp启动子介导的GUS热诱导表达强度接近,但弱于565 bp启动子。启动子缺失分析表明,255 bp启动子含有的5组热激元件是Lehsp23.8启动子热诱导所需要的, 565 bp至255 bp片段之间的AT-rich区对Lehsp23.8启动子的热诱导表达具有增强作用。871 bp至1915 bp片段之间的2组HSE对该启动子的热诱导活性并不起增强作用。Lehsp23.8启动子中565 bp以内的序列足以响应低温、外源ABA及重金属胁迫应答,预测的远程胁迫相关元件(如C-repeat_DRE,ABRE,AP-1)在Lehsp23.8启动子的低温、外源ABA及重金属胁迫应答过程中并不起作用,可能近端的HSE与AT-rich区在这些过程中发挥重要作用。3.为了进一步研究近端HSE元件及AT-rich区在Lehsp23.8启动子胁迫应答中的作用,对该启动子进行了AT-rich1-4叠加、AT-rich1-5缺失、AT-rich3-4缺失、AT-rich1-2缺失及近端5组HSE突变分析,构建gus融合载体pK∞AT14、pK△AT15、pK△AT34、pK△AT12、pK*HSE,转化烟草。对不同突变启动子转化株系在热激、低温、外源ABA及重金属Pb2+胁迫条件下的GUS荧光活性进行测定。AT-rich1-4叠加的启动子介导的GUS热诱导表达高于871 bp启动子,但低于565 bp启动子,说明-565 ~ -235 bp之间331 bp片段具有增强作用,但是与启动子核心元件距离变远时便有抑制作用;缺失AT-rich1-2和缺失AT-rich3-4的启动子介导的GUS热诱导活性明显低于871 bp启动子,甚至低于255 bp启动子,说明AT-rich1-2和AT-rich3-4具有非常重要的增强作用;突变近端5组HSE元件后转基因植株失去热诱导活性。另外,AT-rich1-4叠加以后转基因植株GUS热激表达沉默率降低,而AT-rich1-2、AT-rich3-4及AT-rich1-5缺失以后GUS热激表达沉默率提高。AT-rich1-4序列叠加及AT-rich3-4缺失的启动子仍能介导GUS的低温诱导表达,而缺失AT-rich1-2和缺失AT-rich1-5及HSE元件突变的启动子不能介导GUS的低温诱导表达,说明,Lehsp23.8启动子中HSE元件和AT-rich1-2序列在Lehsp23.8基因的低温表达过程中起重要作用,而AT-rich3-4序列在Lehsp23.8基因的低温诱导表达过程中并不起主要作用。ABA诱导表达模式与重金属诱导表达模式类似, AT-rich1-4叠加、AT-rich1-2缺失、AT-rich3-4缺失启动子仍能介导GUS的ABA及重金属诱导表达,而缺失AT-rich1-5或突变HSE元件的启动子不能够介导GUS的ABA及重金属诱导表达。Lehsp23.8启动子的ABA与重金属应答过程可能具有类似的途径。本论文主要创新点:1.首次克隆了多胁迫诱导型Lehsp23.8启动子。通过与gus基因融合,在转基因番茄中分析了Lehsp23.8启动子热诱导的组织特异性及发育性表达特征,并证明该启动子是受热激、低温、外源ABA及重金属胁迫诱导。2.首次采用热激蛋白基因启动子与gus基因融合的方法来分析番茄果实中热激蛋白的表达模式。详细分析了Lehsp23.8启动子在不同发育时期番茄果实中的热诱导表达特征,证明该启动子的热诱导活性依赖于番茄果实的发育时期。3.首次对Lehsp23.8启动子的元件进行了较为详细的分析。证明AT-rich区对该启动子具有重要的增强作用,并影响转基因沉默率。首次证明Lehsp23.8启动子的AT-rich区和HSE元件协同作用来决定热激蛋白的冷诱导表达。