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【背景】沙眼衣原体泌尿生殖道感染是国内外常见的性传播疾病,且发病率逐年上升,近年来已居于性传播疾病的首位。据WHO统计,全世界每年大约新发沙眼衣原体感染约9200万。大约2/3的沙眼衣原体感染者没有临床症状,易被忽视,无法得到及时的诊治,引起一系列严重的并发症和后遗症。衣原体是一种区别于普通细菌的,具有特殊生物学特性的病原体,而临床上将其作为普通细菌,给予抗生素治疗,效果欠佳。衣原体噬菌体是一种以衣原体为宿主的噬菌体,部分衣原体噬菌体能引起宿主衣原体始体裂解性感染,并依靠简单的粘附作用传给下一代原体。利用衣原体噬菌体引起衣原体病变并使之裂解的特点,可将其作为生物制剂用于衣原体感染的治疗,但目前尚未发现沙眼衣原体的噬菌体。我们课题组前期研究发现将纯化的豚鼠嗜衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1作用于沙眼衣原体,能明显抑制体外沙眼衣原体感染,对Vp1蛋白结构进行分析发现,其含有七个插入环,其中一个较大的插入环-IN5环暴露在噬菌体衣壳蛋白表面形成蘑菇样的突起,推测Vp1蛋白的IN5环结构可能为最重要的功能区。【目的】探索M13-IN5重组噬菌体对E型沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的作用。【内容】鉴定M13-IN5重组噬菌体IN5环目的片段;检测M13-IN5重组噬菌体的效价;研究M13-IN5重组噬菌体IN5环蛋白的表达;将构建成功的M13-IN5重组噬菌体对沙眼衣原体E型标准株（CtE）和豚鼠嗜衣原体（Chlamydiadophila caviae）进行干预,利用光镜观察CtE在感染36h、48h、60h、72h的变化并检测各干预时间点噬菌体活性,利用免疫荧光显微镜观察豚鼠嗜衣原体在感染20h、24h、28h、32h的变化;利用激光扫描共聚焦显微镜精确定位M13-IN5重组噬菌体在Hela细胞内的位置。【方法】利用双层平板法检测重组噬菌体的效价。DNA提取试剂盒提取噬菌体DNA,进行PCR、酶切、测序,验证重组噬菌体。提取噬菌体蛋白,Western Blot检测重组噬菌体IN5环蛋白的表达。利用成功重组的噬菌体干预CtE,在CtE的培养过程中,加入效价均为1011PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预,并设置CtE对照组和空白对照组,在干预36h、48h、60h、72h,普通光学显微镜下观察M13-IN5重组噬菌体对CtE作用;在干预36h,利用激光扫描共聚焦显微镜,观察M13-IN5重组噬菌体在Hela细胞内的位置;收集噬菌体干预实验各时段的培养基,用双层平板法检测噬菌体的效价,判断重组噬菌体的活力和重组噬菌体在干预各时段的存活情况。在豚鼠嗜衣原体的培养过程中,加入效价均为1011PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预,并设置豚鼠嗜衣原体对照组和空白对照组,在干预20h、24h、28h、32h,通过免疫荧光显微镜观察M13-IN5重组噬菌体对豚鼠嗜衣原体的作用。【结果】利用DNA重组技术获得M13-IN5重组噬菌体,挑取单克隆扩增M13-IN5重组噬菌体,通过噬菌斑计数得到M13-IN5重组噬菌体滴度,LB平板培养显示,M13-IN5重组噬菌体噬斑形成单位PFU=3.05×1011/ml,提示M13-IN5重组噬菌体具有生物活力。M13-IN5重组噬菌体在大小约55kDa处有一较浓的蛋白带,其大小正好与IN5环和M13噬菌体pIII外壳蛋白的融合蛋白（58.2kDa）大小相当,M13噬菌体组和大肠杆菌ER2738组在相应位置无条带,这说明重组噬菌体IN5基因能够正常表达。激光扫描共聚焦定位显示,M13-IN5重组噬菌体荧光与CtE包涵体荧光存在重叠。M13-IN5重组噬菌体对CtE及豚鼠嗜衣原体均有抑制作用;CtE感染36、72 h时,M13-IN5重组噬菌体组和M13噬菌体组的包涵体数目较CtE对照组降低（P<0.05）,而且M13-IN5重组噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组有明显降低（P<0.05）,而感染48 h、60h时,M13-IN5重组噬菌体组、M13噬菌体组、CtE对照组包涵体数目无明显区别（P>0.05）;在豚鼠嗜衣原体感染中也出现沙眼衣原体干预实验类似的结果,豚鼠嗜衣原体感染28h、32h,M13-IN5重组噬菌体组和M13噬菌体组的包涵体数目较豚鼠嗜衣原体对照组降低（P<0.05）,而且M13-IN5重组噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组明显降低（P<0.05）,豚鼠嗜衣原体感染20h、24h,M13-IN5重组噬菌体组、M13噬菌体组、豚鼠嗜衣原体对照组包涵体数目无明显区别（P>0.05）。【结论】M13-IN5重组噬菌体具有生物活性,且能够成功表达IN5环蛋白;在体外实验中,M13-IN5重组噬菌体能进入衣原体包涵体内,且能明显抑制增殖期的沙眼衣原体E型标准株和生长周期晚期的豚鼠嗜衣原体感染。