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目的通过线栓法制备SD大鼠大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌注模型,观察同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)对脑缺血再灌注大鼠抑郁行为的影响;通过Hcy分别与NMDA阻断剂MK-801和自噬抑制剂3MA联合干预,探讨体内NMDA受体介导的突触可塑性和自噬调控的神经再生在Hcy引起的梗死后抑郁中的调控作用;体外培养原代神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),通过建立氧糖剥夺/复氧(Oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,来检测Hcy对NSCs活力的影响,通过Hcy与经典自噬通路PI3K-AKT-和ERK-依赖的mTOR信号通路激活剂的联合干预,探讨Hcy对OGD/R NSCs自噬通路的具体调控机制;为防治与HHcy相关的梗死后抑郁提供新的治疗方法及实验依据。方法120只体重为170-180 g的雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为7组,分别为假手术组(SHAM)组、大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO)组、MCAO+同型半胱氨酸组(MCAO+HCY)组、MCAO+HCY+MK-801组、MCAO+MK-801组、MCAO+HCY+3MA组及MCAO+3MA组,其中SHAM、MCAO和MCAO+HCY组,每组分别24只,其他各组12只/组;各组大鼠均适应性喂养7 d,SHAM与MCAO组以4 mL/kg?d剂量尾静脉注射生理盐水,MCAO+HCY和MCAO+HCY+3MA组造模前,以4 mL/kg?d剂量尾静脉每天注射0.8 mg/mL Hcy干预28 d,MCAO+MK-801和MCAO+HCY+MK-801术前15 min腹腔注射MK-801(3 mg/kg),于术后14 d测定糖水偏好和矿场实验;高效液相法检测大鼠血浆中5-HT、DA和NE水平;透射电镜观察大脑海马的突触数量及结构改变;Western blot检测海马中NR1、NR2A、NR2B、PSD-95、SNAP-25、VGLUT1及Complexin I/II蛋白表达;MCAO+3MA和MCAO+HCY+3MA组在术前5 d,每天尾静脉注射5 mM 3MA溶液(4 mL/kg),于造模后3 d和7 d分别用生理盐水和多聚甲醛进行灌注,免疫荧光检测脑组织中SVZ区NSCs LC3表达情况。体外培养NSCs,LDH和MTT法分别测定细胞损伤和增殖活力;Western blot检测NSCs中LC3、Beclin 1、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-ERK和ERK表达情况。结果与MCAO组比较,Hcy干预组:矿场实验结果显示,水平运动距离和站立次数减少;糖水偏好检测结果显示,糖水偏好指数降低;高效液相检测血浆中5-HT、DA和NE水平降低;透射电镜观察显示突触数量减少及突触后致密物面积和宽度减少;Western blot检测结果显示,海马组织中突触相关蛋白SNAP-25、PSD-95、VGLUT1和Complexin I/II表达均降低,NMDA受体蛋白NR1、NR2A和NR2B表达均升高。与MCAO+HCY组相比,MCAO+HCY+MK-801组水平运动距离和站立次数增多;糖水偏好指数升高,血浆中5-HT、DA和NE水平升高;透射电镜下突触数量及突触后致密物面积和宽度增加;Western blot结果显示,海马组织SNAP-25、PSD-95、VGLUT1和Complexin I/II表达均升高,NMDA受体蛋白NR1、NR2A和NR2B表达均降低。与MCAO+HCY组比较,MCAO+HCY+3MA组大鼠SVZ区Nestin与LC3双标阳性细胞数显著减少,大鼠SVZ区NSCs LC3荧光点数减少,荧光点数两组之间存在差异,且差异具有统计学意义(P<0.05)。体外培养NSCs,建立细胞OGD/R模型。Western blot结果显示,与Normal组比较,OGD/R模型组自噬标记蛋白LC3和Beclin 1表达增加,p-PI3K、p-AKT、p-ERK和p-mTOR蛋白表达降低;Hcy干预后自噬标记蛋白LC3和Beclin 1表达进一步增加,p-PI3K、p-AKT、p-ERK和p-mTOR蛋白表达进一步降低。用不同浓度自噬抑制剂3MA与Hcy联合干预后,与OGD/R+HCY组相比,LDH与MTT结果显示适当抑制自噬可以增加NSCs的细胞活力和增殖活力,差异具有统计学意义(P<0.05)。用mTOR激活剂MHY1485、PI3K激活剂IGF-1、ERK激活剂TPA和Curcumin分别与Hcy联合干预NSCs,Western blot结果显示,与OGD/R+HCY组相比,OGD/R+HCY+MHY1485组的p-mTOR蛋白表达升高,LC3和Beclin 1表达降低;OGD/R+HCY+TPA组和OGD/R+HCY+CUR组p-mTOR蛋白表达升高;OGD/R+HCY+IGF-1组p-AKT和p-mTOR蛋白表达升高,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。与OGD/R组比较,OGD/R+MHY1485组的p-mTOR蛋白表达升高,LC3和Beclin 1表达降低;OGD/R+TPA组和OGD/R+CUR组p-mTOR蛋白表达升高;OGD/R+IGF-1组p-AKT和p-mTOR蛋白表达升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立大鼠脑缺血再灌注模型,发现Hcy干预能减少海马突触数量及突触蛋白的表达,进而引发抑郁行为,在给予NMDA受体抑制剂MK-801后,NR1、NR2A和NR2B表达降低,血浆中5-HT、DA和NE水平升高,抑郁症状缓解,突触数量及蛋白表达增加,故Hcy可能通过改变NMDA受体亚基表达来减少突触结构和功能,影响突触可塑性来加重抑郁症状。Hcy通过过度激活脑缺血再灌注后脑组织SVZ区NSCs自噬,从而抑制NSCs增殖活力,在给予自噬抑制剂3MA后,Hcy引起的自噬在一定程度上被抑制,因此Hcy导致的梗死后抑郁症状可能与激活NSCs自噬从而影响神经再生有关。此外在体外NSCs OGD/R模型中,检测到Hcy上调NSCs中LC3和Beclin 1,下调p-PI3K、p-AKT、p-ERK和p-mTOR,细胞活力显著下降。给予自噬抑制剂3MA后,细胞活力显著增加。给予PI3K激活剂IGF-1、ERK激活剂TPA和Curcumin后,mTOR通路下游磷酸化蛋白表达不同程度升高;给予mTOR激活剂MHY1485后,自噬蛋白LC3和Beclin 1表达量下降,p-mTOR表达量升高,提示Hcy可能通过PI3K-AKT和ERK-依赖的mTOR信号负性调节自噬。