顺铂通过ER stress-PGC-1α信号轴诱导乙型肝炎病毒再激活的分子机制研究

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研究目的:目前全球约有3.5亿乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染者,HBV流行区域主要集中于西部太平洋地区及非洲,每年约有80万人死于HBV相关肝硬化和肝癌等并发症。多数情况下,慢性HBV感染者和无症状携带者较少发生HBV再激活现象,但当接受肿瘤化疗或免疫抑制剂治疗时,处于静息状态或低水平复制状态的HBV活化,病毒大量复制使肝功能受到损伤,从而导致急性肝炎、重症肝炎、甚至肝衰竭等为严重的临床问题,患者被迫中断化疗治疗,加重病情的发展。因此,从分子水平解析HBV再激活的机制,将为获得相应的临床解决方案奠定基础。生理情况下,内质网(ER)是参与脂质代谢、蛋白质加工、钙离子储存并维持细胞内环境动态平衡的重要场所,而当细胞应对缺氧、病毒感染、低血糖等应激状态下,均能诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),内质网应激主要有三条重要的信号通路,即肌醇需酶1(Inositol requiring enzyme 1,IRE1),活化转录因子6(activated translation factor,ATF6),以及蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinas,PERK),各自平行激活蛋白质未折叠反应(unfolded protein response,UPR),一方面可降解和清除错误折叠或未折叠的蛋白质,从而维持细胞内环境的稳态,发挥保护作用;另一方面在病毒感染宿主细胞并诱发疾病的过程中也起着关键性的作用,比如,HBV的前S蛋白在宿主细胞中表达,通常会诱导内质网应激的发生;HBV的X蛋白则通过激活后的内质网应激,上调cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element bindingprotein 1,CREB1),共同促进自身蛋白质的合成和病毒的复制,从而促进肝炎、肝硬化以及肝癌的发生。另外,有研究报道,适度的内质网应激有利于细胞存活,从而促进肿瘤细胞的生长,这也可能是肿瘤细胞发生耐药机制之一。乙肝病毒再活化的初始机制一方面认为细胞毒性药物以及免疫抑制剂干扰宿主免疫系统,从而引起全身性免疫耐受;另一方面认为入侵后的病毒可诱导自身突变,从而逃脱免疫监视。但随后的研究发现HBV再激活主要发生在抗癌药物使用的间断期,这表明了乙肝病毒再激活还可能与药物直接作用具有相关性。越来越多的数据表明,细胞毒性化疗药物,包括阿霉素、依托泊苷或长春新碱都可以通过剂量依赖性的方式直接刺激乙肝病毒复制和HBsAg分泌。顺铂(cisplatin,DDP)作为广谱细胞毒性抗癌药物,也是临床联合化疗方案中广泛使用的铂类化疗药物,对肝癌细胞具有直接的细胞毒作用,其在体外HBV复制细胞模型中,是否也具有直接刺激HBV复制的能力,如果有其可能的机制是什么?课题组前期已在HBV复制的细胞模型和HBV转基因小鼠模型中证实顺铂可通过刺激PGC-1α以及HNF-4α的表达,增强HBV核心启动子活性,进而促进乙肝病毒的复制和病毒蛋白表达,为了进一步解析顺铂诱导乙肝病毒再激活的具体分子机制,故本研究旨在从以下几个方面进行深入探讨:1)顺铂对内质网应激相关信号通路的影响;2)内质网应激信号通路对乙肝病毒复制的影响;3)内质网应激信号通路对转录因子PGC-1α表达的情况;4)在HBV转基因小鼠模型中验证顺铂通过激活ERS-PGC-1α轴促进HBV的复制。实验方法:1.在HBV稳定表达的肝癌细胞系HepG2.2.15和HepAD38细胞中,转染表征内质网应激激活的启动子报告质粒ERSE,加入顺铂或者顺铂联合内质网应激激动剂Tg、内质网应激抑制剂PBA以及IRE-1特异性抑制剂4μ8c等药物处理48-72h后,采用Western blot、Real-Time PCR以及荧光素酶报告基因活性等实验方法,检测顺铂对内质网应激相关信号通路的影响。2.同样在HBV稳定表达的肝癌细胞系HepG2.2.15和HepAD38细胞中,直接加入顺铂或者顺铂联合内质网应激激动剂Tg、内质网应激抑制剂PBA以及IRE-1特异性抑制剂4μ8c等药物处理72-96h后,采用Western blot、Real-Time PCR、ELISA、Southern blot等实验方法,检测顺铂对乙肝病毒蛋白表达以及病毒复制的水平是否会受内质网应激的调控。3.在HBV稳定表达的HepAD38细胞中转染PGC-1α启动子,加入顺铂或者联合Tg、PBA以及4μ8C等药物处理72-96h后,采用ChIP、Real-Time PCR、Western blot、荧光素酶报告基因活性等实验方法检测激活或抑制内质网应激后,是否会影响顺铂调控PGC-1α蛋白表达的情况。4.在转基因小鼠模型中,通过尾静脉注射顺铂或者顺铂联合腹腔注射PBA或者4μ8C等药物处理6-7天后,采用ELISA、IHC、Western blot、Real-Time PCR以及Southern blot等实验方法验证顺铂通过诱导ERS-PGC-1α轴促进乙肝病毒复制的情况。实验结果:1.Western blot、Real-Time PCR以及荧光素酶启动子报告质粒ERSE活性等实验结果表明,与PBS对照组相比较,DDP或者Tg处理后,内质网应激相关信号通路UPR反应激活、其启动子活性明显增高,而联合PBA或4μ8C后,不仅UPR反应受抑制,且也部分逆转顺铂介导的内质网应激反应激活元件ERSE启动子的活性,其差异具有统计学意义(p<0.05)。2.Western blot、Real-Time PCR、ELISA、Southern blot等实验结果表明:与PBS对照组相比较,经Tg或者DDP处理后,不仅内质网应激相关因子表达增加,且乙肝病毒病毒复制水平明显活化;当DDP联合PBA或者4μ8C处理后,其内质网应相关因子表达水平降低,尤以XBP1s-IRE1相关信号分子下调最为明显,同时也部分逆转了顺铂介导的乙肝病毒再激活,其差异具有统计学意义(p<0.05)。3.荧光素酶报告基因PGC-1α启动子活性实验结果表明,与对照组PBS相比较,处理组DDP可明显促进PGC-1α报告基因的活性,而联合PBA以及4μ8C后,DDP诱导的PGC-1α启动子活性明显受到抑制(p<0.05)。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验分析发现,与对照组PBS相比较,单因素顺铂DDP作用下,转录因子PGC-1α与XBP1-IRE1下游分子CREB-1蛋白结合明显增多,而顺铂DDP联合PBA后,PGC-1α与CREB-1蛋白结合量明显减少(p<0.05)。Western blot结果表明,与对照组PBS相比较,Tg或者顺铂可明显上调内质网应激相关因子(pIRE1、CREB1)、PGC-1α以及乙肝病毒的HBsAg和HBc Ag的蛋白表达量,而顺铂联合PBA或4μ8C后,其部分逆转内质网应激相关因子、PGC-1α以及乙肝病毒的HBsAg和HBcAg的蛋白表达水平,其差异具有统计学意义(p<0.05)。4.在HBV转基因小鼠模型中,与PBS对照组相比较,经DDP处理后的血清或者组织中,Western blot、Real-Time PCR和Southern blot等实验方法均提示ERS相关因子(PERK,XBP1,IRE-1,CREB1)、ERS通路下游转录因子PGC-1α、乙肝病毒蛋白表达水平以及复制水平均明显上调(p<0.05),而DDP联合PBA或者4μ8C处理后,其均可逆转上述指标,且差异具有统计学意义(p<0.05)。实验结论:1.在体外HBV稳定表达的细胞模型中发现,顺铂可诱导诱导内质网应激信号通路的活化,且该通路可被ERS抑制剂PBA、IRE1特异性抑制剂4μ8C所抑制,该实验结果说明了细胞毒性化疗药物顺铂可诱导内质网应激UPR信号通路的活化,主要是XBP1-IRE1信号通路。2.顺铂激活内质网应激信号通路后,诱导HBV蛋白表达以及病毒复制,而ERS抑制剂PBA以及IRE1特异性抑制剂4μ8C均能逆转HBV的复制转录水平,该实验结果证实了顺铂可通过内质网应激信号通路促进乙肝病毒的复制。3.体外细胞实验结果证实顺铂诱导内质网应激活化后,通过激活下游信号分子CREB1直接上调转录因子PGC-1α蛋白的表达,从而促进乙肝病毒的活化;而当顺铂联合ERS抑制剂PBA或者IRE1特异性抑制剂4μ8C后,不仅抑制PGC-1α蛋白的表达,还可逆转乙肝病毒再激活,该研究结果表明顺铂通过PGC-1α促进乙肝病毒再激活过程中需依赖内质网应激相关信号通路的活化。4.在HBV转基因小鼠模型中验证顺铂诱导激活ERS-PGC-1α轴促进HBV的复制,其中内质网应激抑制剂PBA、4μ8C可部分逆转HBV转录复制水平。综上所述,化疗药物顺铂不仅可通过抑制宿主的免疫系统,造成免疫功能紊乱,导致病毒逃逸宿主免疫监控,间接促进HBV复制外;还可以通过激活ERS-PGC-1α信号通路直接刺激HBV转录复制,参与HBV再激活的发生。因此深入阐明HBV持续性感染的生物机制,将对临床预防以及阻断HBV再激活提供指导意义。
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