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目的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)显著延长了EGFR突变肺癌患者的生存期,取得了令人瞩目的治疗效果,然而多数患者在持续用药后发生获得性耐药,探讨EGFR-TKIs耐药的标志物有助于及时调整治疗策略。本研究旨在建立第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药型非小细胞肺癌细胞系的耐药预测模型,并研究奥希替尼获得性耐药分子机制。方法1.首先利用浓度梯度递增方法诱导建立第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药细胞系PC9-OR。外显子PCR+Sanger测序检测EGFR exon 18、EGFR exon 19、EGFR exon 20、EGFR exon 21、Kras exon2、Kras exon3、Kras exon4、Braf exon15、Pik3ca exon9、Nras exon3等耐药突变。2.生物信息学挖掘GEO数据库中耐药细胞表达谱数据,筛选差异表达基因,构建耐药预测模型并评估其诊断效能。3.荧光定量PCR、Western blot法检测上皮间质转化标志物(epithelialmesenchymal transition,EMT)表达情况,质粒转染干扰结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、N-cadherin表达以评估CTGF和Ncadherin对细胞奥希替尼敏感性、细胞凋亡的影响。结果1.PC9细胞于19号外显子上存在5个氨基酸的缺失(ΔELREA);PC9的奥希替尼IC50为0.0079μM(95%CI:0.006μM-0.009μM);建立的耐药细胞系PC9-OR对奥希替尼的IC50为21.24μM(95%CI:9.39μM-48.03μM),耐药指数RI=2688;形态上,PC9呈长梭型类似于上皮细胞形态,PC9-OR偏圆呈间质细胞样,鬼笔环肽染色显示PC9-OR出现伪足样改变;PC9-OR未检测到常见的EGFR 19号外显子C797S/G、L798I、792F/H、G796S/R、L718Q;Kras 2号外显子G12S、G12A、G12D、Q61H,3号外显子Q61H,4号外显子A146T;Nras 3号外显子E63K,BRAF 15号外显子V600E,PIK3CA 9号外显子E545K等耐药突变;PC9和PC9-OR对顺铂的IC50分别为2.403μM(95%CI:2.138μM-2.701μM)、2.818μM(95%CI:2.485μM-3.196μM);PC9和PC9-OR对吉非替尼的IC50分别为0.056μM(95%CI:0.027μM-0.118μM)、44.29μM(95%CI:8.355μM-234.8μM);PC9和PC9-OR的细胞增殖曲线二者差异无统计学意义。2.分析GEO数据库(GSE106765,GSE75602和GSE103350),鉴定出多个AZD9291耐药相关差异基因,分别有47、372、45个表达上调的基因,其中共同表达上调的有3个,为MRAS、CTGF和ANKRD1。在独立数据集GSE35228中用ROC曲线验证筛选出的相对高表达基因用于预测第三代EGFR-TKI耐药的诊断效能,结果显示,MRAS、MET、ANKRD1、MCAM、FGFR1具有较好的诊断效能,联合诊断ROC曲线下面积AUC=0.9822。3.RNA水平上PC9-OR的Vimentin表达明显上调,而E-cadherin表达差异没有统计学意义,蛋白水平上N-cadherin表达显著上调而E-cadherin和Vimentin的差异不明显;以CTGF sh1作为干扰质粒干扰PC9-OR CTGF的表达后,细胞IC50为7.493μM(95%CI:5.751μM-9.764μM),以CTGF sh2作为干扰质粒干扰后细胞IC50为8.696μM(95%CI:4.645μM-16.28μM),而对照组细胞IC50为7.958μM(95%CI:6.640μM-9.537μM);以N-cadherin sh1作为干扰质粒干扰PC9-OR的N-cadherin表达后,细胞IC50为4.043μM(2.850μM-5.735μM),以N-cadherin sh2作为干扰质粒干扰后细胞IC50为3.811μM(2.862μM-5.074μM),而对照组细胞IC50为7.958μM(6.640μM-9.537μM);在PC9-OR中干扰N-cadherin的表达后,N-cadherin sh1组和N-cadherin sh2组的凋亡细胞比例显著高于对照组。结论1.成功诱导建立了第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药细胞系PC9-OR,其对奥希替尼的IC50为21.24μM(95%CI:9.39μM-48.03μM),耐药指数高达RI=2688。该耐药细胞系对第一代EGFR-TKI吉非替尼也表现出耐药,耐药指数高达791,而对传统的铂类化疗药物顺铂表现为和亲本PC9细胞一样都较敏感。其耐药机制不依赖于EGFR19号外显子C797S/G、L798I、792F/H、G796S/R、L718Q,Kras2号外显子G12S、G12A、G12D、Q61H,3号外显子Q61H,4号外显子A146T;Nras 3号外显子E63K,BRAF 15号外显子V600E,PIK3CA 9号外显子E545K等常见耐药突变。2.发现一组基因MRAS、MET、ANKRD1、MCAM、FGFR1可以作为EGFR-TKI耐药的标志,成功构建了奥希替尼耐药预测模型,可能为临床及时发现患者EGFR-TKI耐药提供实验依据。3.PC9-OR间质细胞标志物N-cadherin、Vemintin表达增加。干扰PC9-OR的Ncadherin表达能增加细胞对奥希替尼的敏感性。N-cadherin可能通过诱导细胞向间质细胞表型转化、抑制细胞凋亡而诱导奥希替尼耐药,成为潜在的治疗靶点。