烟曲霉是一种重要的条件致病真菌,发病率仅次于白假丝酵母,位于深部真菌感染第二位。一般来说,烟曲霉感染人体时主要是以孢子的形式沿呼吸道进入肺泡,在肺泡表面存活、定植、萌发,最终向下侵袭生长入血,引起系统性真菌感染。利用T-DNA及转座子等技术插入染色体DNA,获得插入突变体的反向遗传学方法,是研究植物、真菌等生物基因功能的一种重要方法。本实验室前期工作中已建立了烟曲霉T-DNA插入突变体库,用于烟曲霉基因功能的研究。本研究的主要目的是寻找与烟曲霉生长繁殖相关的基因,并研究其与烟曲霉致病力的关系。经筛选获得形态改变突变体54株,其中3株表型变化明显。在研究过程中,确定突变体插入位点,明确破坏基因是其关键技术之一。然而,现有的方法存在操作复杂,需要限制性内切酶酶切及T-A克隆连接等技术的辅助,阳性率低,有非特异性扩增,耗时长,成本高等缺点。本研究结合降落PCR、热不对称PCR及抑制PCR技术,建立了一种新型高通量的插入位点分析方法。该方法阳性率高,操作简便快捷,节省时间、人力及物力。获得的侧翼序列长度在300-2500bp之间,可满足插入位点的生物信息学分析,为高通量分析插入位点提供技术支撑。在此基础上,应用该技术对烟曲霉T-DNA插入突变体库T-DNA插入位点进行分析。对其中一株白化突变株AFM1006进行深入的基因功能研究,确定其打断基因为烟曲霉几丁质合酶csmB基因,其影响的表型变化为烟曲霉分生孢子梗顶囊产生小梗的分化过程出现障碍。该成果可为寻找影响烟曲霉菌株形态分化相关通路,揭示其生长繁殖的分子机制等提供科学依据。1.烟曲霉形态改变突变体的筛选通过筛选烟曲霉菌株IFM40808的T-DNA插入突变体,获得54株具有表型变化的突变体。其表型变化涵盖菌落生长速度变缓、白化、气生菌丝增多、出现褶皱等。其中三株表型变化明显。菌株AFM2690白化,菌落出现褶皱,菌丝弯曲,粗细不均一;菌株AFM3270,菌落生长极为缓慢;菌株AFM1006白化,菌落大小无明显差异。这些生长繁殖发生改变的突变体为进一步分析烟曲霉生长发育、分化等过程的分子机制提供物质基础。2.高通量插入突变体库插入位点分析方法的建立本研究首次结合降落pcr、热不对称pcr和抑制pcr原理,建立了一种可用于高通量分析插入突变插入位点的方法。其具体方法为:在插入突变区边缘向外连续设计两个半巢式固定端引物,距离边缘较远的引物需要有较高的退火温度,用于预扩增;距离边缘较近的引物用于第二轮扩增。另一端使用在5`端有特定保守dna片段的简并引物随机与模板结合。非特异性片段会因其单链两端反向互补倒读而导致单链成环,无法进一步扩增。在预扩增阶段,通过预扩增-瞬时降温-缓慢升温-再次扩增的方式,尽量提高其扩增阳性率;在第二轮扩增时,随机端引物更换为人为在简并引物5`端加入的特异性片段,使其变为简单的pcr反应,通过降落pcr方法,同时兼顾了特异性和扩增效率。经过两轮pcr扩增后即可扩增特异性目标条带,仅切胶回收无需t-a克隆即可测序。经实验摸索,模板dna的完整性是反应能否正确完成的关键。该方法仅需在插入位点边缘连续设计两轮半巢式引物,且仅第一轮引物需要较高的退火温度,相较原有连续三轮半巢式引物,均需要较高的退火温度来说,引物设计的难度大大降低。扩增产物不需要t-a克隆,简单易行,单一pcr仪一批次可完成96个样品,从基因组提取到完成测序反应从原有的至少四天,减少至三天内完成,单个样品分析成本由原有的60元降低至25元以内,适合于插入突变位点的高通量分析。该方法已成功应用于本实验室烟曲霉、土曲霉、申克氏孢子丝菌、尖孢镰刀菌atmtt-dna插入突变体库插入位点的分析。已成功确定100余株烟曲霉插入位点,为揭示烟曲霉分子机理、探讨致病机制等奠定了坚实的基础。3.烟曲霉白化突变株afm1006基因功能研究通过分子分析确定筛选获得的烟曲霉白化突变株afm1006打断区域为假定的几丁质合酶基因,对其结构域分析最终确定其为烟曲霉v类几丁质合酶csmb。通过肉眼观察、乳酸酚棉蓝染色光学显微镜观察、荧光白染色荧光相差显微镜观察、扫描电子显微镜观察及荧光相差显微镜观察等方法确定,该基因的缺失对烟曲霉菌丝延伸速度、菌丝直径、细胞壁厚度、菌丝平均分枝距离和平均分隔距离、足细胞的分化、菌丝细胞壁几丁质含量等均无明显变化;仅影响了分生孢子梗上顶囊分化产生小梗的过程,进而影响孢子的产生。通过分光光度法和Real-time PCR法对突变体进行生理生化分析,确定突变体菌株几丁质总含量无明显变化,csmB基因不表达而其他的几丁质合酶具有不同程度的代偿性表达上调。对该基因氨基酸序列进行分析,发现其包含三个结构域,分别为肌球蛋白头部结构域、细胞色素b5样结构域和几丁质合酶结构域C。据此提出假说,烟曲霉几丁质合酶csmB基因仅影响烟曲霉分生孢子梗上顶囊分化生成小梗,其分子机制为该基因表达后受肌动蛋白影响最终成熟于顶囊顶端细胞膜上发挥合成细胞壁几丁质的功能。同时也成功建立了AFM1006菌株回复突变株。本研究成果可为进一步明确烟曲霉生长发育的分子机理,确定烟曲霉的致病机制等提供重要的技术资料。综上,本研究通过筛选烟曲霉形态改变突变体共获得有形态差异的突变体54株,其中3株表型变化明显。首次成功建立了基于降落PCR、热不对称PCR和抑制PCR的插入位点分析技术。该方法操作简单易行、高通量,仅需PCR扩增而不需要限制性内切酶及T-A克隆等技术,从基因组提取到完成测序仅需3天,单个样品成本降至25元以内。本实验室已成功将其应用于多种T-DNA插入突变体库插入位点的分析工作。本研究中已成功确定一百余株烟曲霉T-DNA插入突变体插入位点。对白化菌株AFM1006进行进一步的基因功能分析,最终确定其插入突变位点为csmB基因,仅影响烟曲霉顶囊分化产生小梗。这些研究成果为通过反向遗传学方法探讨病原真菌致病机制、耐药机制等奠定基础,同时,本研究亦可为其他病原真菌、其他插入突变技术研究提供参考和借鉴。