A型流感病毒曾经造成人类历史上数次大流感的暴发,以及2009年甲型H1N1流感大流行,严重威胁人类的健康和生命。对流感的防控和治疗是公共卫生安全的重要内容。应对流感大暴发的策略主要包括:加强平时病毒的监测,准确预测病毒的流行趋势;根据监测数据,做好疫苗更新和储备及日常预防工作;有疫情出现时,除了“快速反应”的储备疫苗使机体快速产出抗体,还应加强抗流感药物的治疗。NP作为流感病毒聚合酶复合体RNPs的一员,在整个流感病毒的生命周期发挥重要功能,参与vRNPs的入核、病毒的转录与复制、与M1蛋白和NEP蛋白一起介导vRNP出核。并且NP在不同亚型流感病毒中高度保守,本身可以作为抗流感药物的良好靶标。NP在流感病毒感染过程中必然与宿主因子发生相互作用。已经报道的有:importinα、CRM1、UAP56和Tat-SF1等。本研究通过酵母双杂交以NP作为诱饵筛选到宿主因子PLSCR1(Phospholipid Scramblase 1),PLSCR1是干扰素和生长因子可诱导的钙结合II型膜蛋白,在人体各种组织(脑除外)广泛分布,生物功能多样,研究发现PLSCR1可以作为细胞内多种蛋白激酶(c-Abl、c-Src、PKC)的底物,说明PLSCR1可能与细胞增殖、分化、或凋亡事件的信号传导相关;PLSCR1作为一种干扰素刺激基因与抗病毒相关的报道主要有:PLSCR1通过泛素-蛋白酶体系统降解乙型肝炎病毒HBV X蛋白,从而抵抗HBV的感染复制;PLSCR1可以干扰丙型肝炎病毒进入宿主细胞。本研究首次筛选到PLSCR1与流感病毒NP之间的相互作用。本文通过以下实验探讨PLSCR1与NP之间的作用如何影响流感病毒复制。(1)CO-IP验证两者在真核细胞中存在相互作用,而且这种互作不需要RNA的参与,共聚焦结果显示两者共定位于胞浆中,通过CO-IP对PLSCR1与NP互作的区段定位在250-318位AA之间;(2)293T细胞瞬时过表达或siRNA干扰PLSCR1后检测流感聚合酶活性的变化,结果显示过表达对聚合酶活性的降低程度甚微,而siRNA干扰PLSCR1表达后聚合酶活性能够升高15倍左右,以聚合酶活性变化间接说明PLSCR1对流感病毒的复制起抑制作用;(3)以逆转录病毒包装系统建立过表达细胞系A549-PQCXIN-PLSCR1及其对照细胞系A549-PQCXIN,在病毒感染的整体水平上评估PLSCR1对病毒复制的影响,结果发现过表达PLSCR1后使病毒复制的滴度下降100多倍,从激光共聚焦结果也可以发现,过表达细胞系上NP的入核明显受到抑制;然而siRNA干扰A549內源PLSCR1后对病毒复制的促进作用却并不明显,过表达细胞系siRNA感染互补实验结果也与以上结果一致;(4)PLSCR1抑制流感病毒复制的机制研究:a.已有研究报道NP S9、Y10两个位点突变为磷酸化模拟氨基酸E使NP的入核受到影响,那么把S9、Y10分别突变为去磷酸化模拟氨基酸A和F,以突变毒与野生毒感染过表达细胞系和对照细胞系,结果发现突变病毒在过表达细胞系上的复制抑制程度与野生病毒一样,说明PLSCR1不是通过改变NP磷酸化状态而影响病毒复制的;b.NP入核需要与importinα结合,而PLSR1也存在一个非经典的核定位信号,[257GKISKHWTGI266]同样与importinα结合,所以推测PLSCR1抑制病毒复制是否由于与NP竞争结合importinα所致,同时转染importinα、NP及PLSCR1三种蛋白的质粒,使PLSCR1呈递增趋势表达,用CO-IP以恒量importinα沉淀NP,实验结果发现NP的量并没有像推测的那样出现递减的趋势,而是三者形成稳定的复合体,对照病毒感染激光共聚焦结果观察发现NP与PLSCR1共定位与胞浆中,而且PLSCR1没有入核的趋势,说明三者形成复合体之后PLSCR1使NP的入核受到干扰,进一步影响了病毒的复制。1996年在中国南部首次从鹅群中分离到H5N1高致病性禽流感(HPAI)病毒[1]。由A/goose/Guangdong/1996进化而来的病毒不仅给养禽业造成相当大的损害,而且对人类健康构成威胁。例如:1997年在香港暴发人感染H5N1病毒事件[1]。据2016年1月20日(世界卫生组织,世界动物卫生组织)最新数据显示:自2003年以来,H5N1病毒逐渐扩散到其他地区,在过去的十年,已经在亚洲、欧洲和非洲60多个国家多次暴发,导致846人感染,其中致死449人。A型流感病毒进化方式分为两种:随着时间积累导致病毒的适应性突变;以及不同病毒之间RNA片段重配[2]。2005年,在中国西部的青海湖野鸟中暴发的H5N1,导致约6000多只野鸟死亡[3,4].。Qinghai-lineage进化分支(Clade 2.2)PB2的627位获得了谷氨酸到赖氨酸(E627K)的突变,这个位点的突变在甲型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9流感病毒的人类分离株中均能发现,是AIV适应人的分子标记[5-7]。幸运的是,当前青海湖病毒只有引起世界各地零星的人类感染(WHO)。病毒重组是导致大流行性出现和传播的另一个重要的原因,人类历史上的流感大流行以及最近H7N9暴发都是病毒重配的例子[7-11]。2005年青海湖野鸟暴发H5N1 HPAIV后,被迅速传播到埃及[12]。自此以后,起源于Qinghai-lineage病毒在埃及流行并引起多次暴发,导致大批人被感染。进化分析,在埃及流行的H5N1病毒都属于clade2.2.1分支及其子分支[13]。到2014年底,经实验室确诊报告给世界卫生组织的病例总共有210例其中77人死亡,然而2015年感染人的病例显著增加,共136例其中39人死亡。就2015年人感染病例的数量是过去九年的大约70%。当前H5N1并没有持续的人传人的能力,然而由于流感病毒突变频繁,它会在进化过程中获得适应哺乳动物宿主的合适突变。值得注意的是,埃及的H5N1病毒已经获得了PB2 627 k的突变,包括在血凝素(HA、聚合酶蛋白上的突变,以及与其它亚型流感病毒的重组都促进病毒在人类之间的有效传播。有几项研究表明,通过在HA上突变三到四个氨基酸就会导致HA对Siaα2,6唾液酸受体的亲和力增加,或者通过从2009年大流行病毒株(H1N1)中获得PA、NS片段可以提高聚合酶活性,都会导致H5N1在哺乳动物模型之间的有效传播[14-16]。埃及禽流感形式严峻,因此,了解流行于埃及的新的2.2.1.2分支禽流感毒株的生物学特性非常有必要。分别选取2014和2015年的两株埃及H5N1病毒,进行受体特性、致病性以及传播能力的研究,为该地区流感的防控提供实验指导。