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目的：
采用体内、外实验探讨阿可拉定(Icaritin)抗宫颈癌作用及对鞘氨醇激酶1(SphK1)表达的影响。通过过表达SiHa细胞中SphK1表达水平，研究阿可拉定介导的细胞毒性，同时利用CCK-8实验、划痕愈合实验和Transwell实验评估阿可拉定及SphK1过表达对SiHa细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭能力的影响，利用裸鼠体外成瘤模型评估阿可拉定和过表达SphK1对Siha细胞体内成瘤的影响，从而为宫颈癌临床治疗提供新思路。
方法：
(1)体外通过细胞实验探讨阿可拉定抗宫颈癌作用效果：实验分为①空白对照组；②SphK1空载体对照组；③SphK1过表达组；④阿可拉定组；⑤SphK1过表达+阿可拉定组；⑥SphK1空载体对照+阿可拉定组。选用不同浓度阿可拉定(0、5、10、15、20及50μmol/L)，采用CCK-8实验方法，对宫颈癌细胞系Siha进行24h，48h，72h，96h的阿可拉定药物处理，检测不同药物浓度、不同作用时间对肿瘤细胞增殖的抑制作用。同时，采用流式细胞法检测SiHa细胞凋亡，细胞划痕实验和Transwell实验检测SiHa细胞的迁移能力和侵袭能力。RT-PCR和蛋白质印记法检测目的基因SphK1mRNA及蛋白表达。
(2)体内通过动物水平探讨阿可拉定抗宫颈癌作用效果：建立裸鼠体外移植瘤模型，建模成功后，将实验分为四组：?生理盐水组；?阿可拉定组；?SphK1过表达+阿可拉定组；?SphK1空载体对照+阿可拉定组。进行阿可拉定的抗宫颈癌实验研究。给药期间每隔2天称老鼠体重和测量瘤体大小，观察并记录体重和瘤体变化，共38天。最后一次治疗后两天，处死所有裸鼠。使用公式计算肿瘤体积(L×W2)/2大小，测量肿瘤重量并以克为单位记录数据。
结果：
1．阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌细胞的抗肿瘤作用
(1)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞增殖的影响：CCK-8实验结果显示，阿可拉定处理Siha细胞，可抑制SiHa细胞的增殖，同时上调SphK1表达(p＜0.001)；通过过表达SphK1实验发现，其实验效果与阿可拉定抗宫颈癌具有协同作用(p＜0.001)；
(2)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞凋亡的影响：通过慢病毒感染和筛选稳定株获得过表达SphK1的SiHa细胞株，用50uM的阿可拉定处理72h后对各组细胞凋亡情况进行检测，研究阿可拉定对SiHa细胞凋亡的作用及对SphK1表达的影响，以及过表达SphK1对细胞凋亡的影响。流式细胞实验结果显示，阿可拉定可增加SiHa细胞凋亡(p＜0.001)，同时上调SphK1的表达(p＜0.001)；SphK1过表达可促进SiHa细胞凋亡(p＜0.001)；
(3)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞迁移的影响：划痕愈合实验结果显示：刮除细胞96h后，对照组中大量的正常SiHa细胞迁移至划痕区，划痕基本愈合(p＜0.01)；过表达SphK1细胞也向划痕区域迁移，但其划痕区域的细胞数量少于对照组(p＜0.01)。加入阿可拉定后，划痕区过表达SphK1细胞数量与对照组SiHa细胞相比明显减少(p＜0.001)。以上结果提示，阿可拉定及过表达SphK1可抑制SiHa细胞迁移；
(4)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞侵袭的影响：Transwell实验结果发现，过表达SphK1细胞穿过基质胶的细胞数量明显少于对照组SiHa细胞(p＜0.0001)，加入阿可拉定后，过表达SphK1细胞穿过基质胶数量与对照组相比显著减少(p＜0.0001)。以上结果提示，阿可拉定及过表达SphK1可抑制SiHa细胞侵袭；
(5)阿可拉定及SphK1过表达对人宫颈癌细胞自噬蛋白p62表达的影响：本研究发现，SphK1过表达可显著下调自噬蛋白p62的表达(p＜0.001)，阿可拉定处理后可得到同样的效果。同时发现，阿可拉定能够显著诱导细胞死亡，并改变p62蛋白水平；过表达SphK1后，阿可拉定诱导的细胞凋亡数目增加(p＜0.001)，p62蛋白表达下降。上述实验结果表明，p62蛋白参与了阿可拉定诱导的细胞死亡，这一现象可能与SphK1过表达有关。
2．阿可拉定及SphK1过表达对人子宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤生长的影响我们在BALB/c-nu裸鼠异种移植瘤模型中检测了SphK1表达及阿可拉定在体内的作用。在本实验中，通过口服给药阿可拉定可显著抑制人子宫颈癌SiHa细胞裸鼠异种移植瘤的生长。SphK1过表达组和阿可拉定给药组的裸鼠，肿瘤大小与载体处理的裸鼠相比明显受到抑制(P＜0.001)。另外发现，裸鼠体重受到阿可拉定及SphK1蛋白过表达的显著影响(P＜0.001)。38天后，所有裸
鼠存活，但有20％裸鼠出现腹部膨大症状，这可能与肿瘤本身有关。更重要的是，在阿可拉定处理的异种移植物中SphK1表达比载体处理的裸鼠升高更明显(P＜0.001)。总之，上述这些结果表明，阿可拉定在体内上调了SphK1表达并协同其抑制了SiHa肿瘤的生长。
结论：
(1)阿可拉定对体外培养的子宫颈癌细胞具有良好的抗肿瘤作用效果。
(2)阿可拉定对人子宫颈癌异种移植瘤的生长具有良好的抑制作用。
(3)阿可拉定可使SphK1表达升高。
(4)阿可拉定和SphK1过表达具有抗宫颈癌协同作用效果。
采用体内、外实验探讨阿可拉定(Icaritin)抗宫颈癌作用及对鞘氨醇激酶1(SphK1)表达的影响。通过过表达SiHa细胞中SphK1表达水平，研究阿可拉定介导的细胞毒性，同时利用CCK-8实验、划痕愈合实验和Transwell实验评估阿可拉定及SphK1过表达对SiHa细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭能力的影响，利用裸鼠体外成瘤模型评估阿可拉定和过表达SphK1对Siha细胞体内成瘤的影响，从而为宫颈癌临床治疗提供新思路。
方法：
(1)体外通过细胞实验探讨阿可拉定抗宫颈癌作用效果：实验分为①空白对照组；②SphK1空载体对照组；③SphK1过表达组；④阿可拉定组；⑤SphK1过表达+阿可拉定组；⑥SphK1空载体对照+阿可拉定组。选用不同浓度阿可拉定(0、5、10、15、20及50μmol/L)，采用CCK-8实验方法，对宫颈癌细胞系Siha进行24h，48h，72h，96h的阿可拉定药物处理，检测不同药物浓度、不同作用时间对肿瘤细胞增殖的抑制作用。同时，采用流式细胞法检测SiHa细胞凋亡，细胞划痕实验和Transwell实验检测SiHa细胞的迁移能力和侵袭能力。RT-PCR和蛋白质印记法检测目的基因SphK1mRNA及蛋白表达。
(2)体内通过动物水平探讨阿可拉定抗宫颈癌作用效果：建立裸鼠体外移植瘤模型，建模成功后，将实验分为四组：?生理盐水组；?阿可拉定组；?SphK1过表达+阿可拉定组；?SphK1空载体对照+阿可拉定组。进行阿可拉定的抗宫颈癌实验研究。给药期间每隔2天称老鼠体重和测量瘤体大小，观察并记录体重和瘤体变化，共38天。最后一次治疗后两天，处死所有裸鼠。使用公式计算肿瘤体积(L×W2)/2大小，测量肿瘤重量并以克为单位记录数据。
结果：
1．阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌细胞的抗肿瘤作用
(1)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞增殖的影响：CCK-8实验结果显示，阿可拉定处理Siha细胞，可抑制SiHa细胞的增殖，同时上调SphK1表达(p＜0.001)；通过过表达SphK1实验发现，其实验效果与阿可拉定抗宫颈癌具有协同作用(p＜0.001)；
(2)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞凋亡的影响：通过慢病毒感染和筛选稳定株获得过表达SphK1的SiHa细胞株，用50uM的阿可拉定处理72h后对各组细胞凋亡情况进行检测，研究阿可拉定对SiHa细胞凋亡的作用及对SphK1表达的影响，以及过表达SphK1对细胞凋亡的影响。流式细胞实验结果显示，阿可拉定可增加SiHa细胞凋亡(p＜0.001)，同时上调SphK1的表达(p＜0.001)；SphK1过表达可促进SiHa细胞凋亡(p＜0.001)；
(3)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞迁移的影响：划痕愈合实验结果显示：刮除细胞96h后，对照组中大量的正常SiHa细胞迁移至划痕区，划痕基本愈合(p＜0.01)；过表达SphK1细胞也向划痕区域迁移，但其划痕区域的细胞数量少于对照组(p＜0.01)。加入阿可拉定后，划痕区过表达SphK1细胞数量与对照组SiHa细胞相比明显减少(p＜0.001)。以上结果提示，阿可拉定及过表达SphK1可抑制SiHa细胞迁移；
(4)阿可拉定及SphK1过表达对宫颈癌Siha细胞侵袭的影响：Transwell实验结果发现，过表达SphK1细胞穿过基质胶的细胞数量明显少于对照组SiHa细胞(p＜0.0001)，加入阿可拉定后，过表达SphK1细胞穿过基质胶数量与对照组相比显著减少(p＜0.0001)。以上结果提示，阿可拉定及过表达SphK1可抑制SiHa细胞侵袭；
(5)阿可拉定及SphK1过表达对人宫颈癌细胞自噬蛋白p62表达的影响：本研究发现，SphK1过表达可显著下调自噬蛋白p62的表达(p＜0.001)，阿可拉定处理后可得到同样的效果。同时发现，阿可拉定能够显著诱导细胞死亡，并改变p62蛋白水平；过表达SphK1后，阿可拉定诱导的细胞凋亡数目增加(p＜0.001)，p62蛋白表达下降。上述实验结果表明，p62蛋白参与了阿可拉定诱导的细胞死亡，这一现象可能与SphK1过表达有关。
2．阿可拉定及SphK1过表达对人子宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤生长的影响我们在BALB/c-nu裸鼠异种移植瘤模型中检测了SphK1表达及阿可拉定在体内的作用。在本实验中，通过口服给药阿可拉定可显著抑制人子宫颈癌SiHa细胞裸鼠异种移植瘤的生长。SphK1过表达组和阿可拉定给药组的裸鼠，肿瘤大小与载体处理的裸鼠相比明显受到抑制(P＜0.001)。另外发现，裸鼠体重受到阿可拉定及SphK1蛋白过表达的显著影响(P＜0.001)。38天后，所有裸
鼠存活，但有20％裸鼠出现腹部膨大症状，这可能与肿瘤本身有关。更重要的是，在阿可拉定处理的异种移植物中SphK1表达比载体处理的裸鼠升高更明显(P＜0.001)。总之，上述这些结果表明，阿可拉定在体内上调了SphK1表达并协同其抑制了SiHa肿瘤的生长。
结论：
(1)阿可拉定对体外培养的子宫颈癌细胞具有良好的抗肿瘤作用效果。
(2)阿可拉定对人子宫颈癌异种移植瘤的生长具有良好的抑制作用。
(3)阿可拉定可使SphK1表达升高。
(4)阿可拉定和SphK1过表达具有抗宫颈癌协同作用效果。