【摘 要】
：
目的:细胞自噬调控细胞内蛋白质和受损细胞器的降解,对细胞生长及维持细胞稳定发挥着重要作用,并在妊娠糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）中发挥重要的作用。自噬的调控是一个复杂过程,而DAPK3是一种介导多种细胞功能的丝氨酸激酶,也被称为死亡相关激酶3（Death-associated protein kinase-3,DAPK3）,主要的生物功能是调控细胞周期
论文部分内容阅读
目的:细胞自噬调控细胞内蛋白质和受损细胞器的降解,对细胞生长及维持细胞稳定发挥着重要作用,并在妊娠糖尿病（Gestational diabetes mellitus,GDM）中发挥重要的作用。自噬的调控是一个复杂过程,而DAPK3是一种介导多种细胞功能的丝氨酸激酶,也被称为死亡相关激酶3（Death-associated protein kinase-3,DAPK3）,主要的生物功能是调控细胞周期,细胞增殖和凋亡。然而其是否调控自噬尚不清楚。因此,本研究的目的是探讨DAPK3在GDM中是否调控自噬,以及在高糖环境下干扰DAPK3对胎盘滋养层细胞结构及功能的影响。方法:（1）胎盘组织中DAPK3的表达:取无妊娠糖尿病及其他疾病的正常孕妇（Normal pregnancy,NP）和GDM患者的胎盘组织,用Western blotting和免疫组织化学方法（IHC）检测胎盘组织中DAPK3的蛋白表达;用quantitative reverse transcription-PCR检测DAPK3的m RNA的表达。（2）建立体外培养滋养层细胞的高糖模型:用不同浓度的葡萄糖（5 mmol/L,15 mmol/L,25 mmol/L,30 mmol/L）处理人绒毛滋养层细胞系（HTR8/SVneo）。分别采用Western blotting、q PCR检测DAPK3的m RNA和蛋白表达。（3）沉默DAPK3对细胞自噬水平及细胞功能的影响:HTR8/SVneo细胞采用Lipo2000转染试剂,转染si DAPK3干扰基因沉默细胞中DAPK3基因,接着采用q PCR检测高糖环境下DAPK3、ATG5、ATG7及Beclin1的m RNA表达水平;用Western blotting检测高糖环境下DAPK3、LC3II、P62、ULK1、ATG5及ATG7的蛋白表达水平;共聚焦显微镜和电镜观察细胞自噬小体的数目;采用Transwell实验检测细胞的侵袭能力。（4）干扰DAPK3对溶酶体功能的影响:实验所用分NC为三组:阴性对照组（30 mmol/L葡萄糖+氯喹）;高糖对照组（30 mmol/L葡萄糖+non-targeting（NC）si RNA）;实验组（30 mmol/L葡萄糖+si DAPK3）。采用Western blotting检测溶酶体膜蛋白LAMP1和LC3II的蛋白表达,采用溶酶体红色荧光探针检测溶酶体功能。（5）干扰DAPK3对溶酶体和自噬小体融合的影响:实验所用分为三组:阳性对照组（30 mmol/L葡萄糖+雷帕霉素）;高糖对照组（30 mmol/L葡萄糖+nontargeting（NC）si RNA）;实验组（30 mmol/L葡萄糖+si DAPK3）。采用Western blotting检测影响自噬小体和溶酶体融合相关蛋白Snap29、STX17和VAMP8的蛋白表达;采用Co-IP和激光扫描共聚焦显微镜检测干扰DAPK3是否影响LAMP1和LC3II之间的相互作用,及Snap29、STX17和VAMP8三者之间的相互作用,并同样检测DAPK3和Snap29之间的相互作用。结果:（1）GDM患者的胎盘组织中DAPK3的表达明显增强,且DAPK3定位于胞质中。（2）与正常组相比,高糖组细胞的DAPK3的表达明显升高,因此,后续实验选取30mmol/L葡萄糖处理细胞。（3）在高糖环境下,干扰DAPK3能够增加HTR8/SVneo细胞中ATG5及Beclin1的m RNA表达水平,并增加LC3II、P62、ULK1、ATG5及ATG7的蛋白表达;和高糖对照组相比,沉默DAPK3组细胞自噬小体的数目增多;且细胞侵袭能力增强。（4）在高糖环境下,与高糖对照组和氯喹对照组相比,干扰DAPK3不改变溶酶体的PH,LAMP1的蛋白表达没有明显差异。（5）在高糖环境下,与高糖对照组和雷帕霉素对照组相比,干扰DAPK3减少STX17的蛋白表达,而Snap29和VAMP8的蛋白表达没有明显差异;干扰DAPK3减少LAMP1和LC3II的相互作用,并减少STX17、Snap29和VAMP8的相互作用。在高糖对照条件下,DAPK3和Snap29相互作用。结论:在高糖环境下,干扰DAPK3能通过增强HTR8/SVneo细胞的自噬水平,改善细胞的侵袭能力;干扰DAPK3可以通过介导Snap29,抑制STX17-Snap29-VAMP8的复合物的形成阻断自噬流。
其他文献
pre-m RNA的可变剪接是真核生物包括人类中普遍存在的一种重要的转录后调控机制,在提高生物体蛋白质多样性,调控细胞生长、分化和发育,维持机体正常生命活动等过程中起重要作用。在已报道可变剪接类型中,内含子保留的研究较少。前期分析发现MAP3K8基因内含子保留现象,鉴于该基因在免疫、炎症和肿瘤中的重要功能,本论文拟通过实验验证MAP3K8基因的内含子保留和其调控机制。本研究发现了MAP3K8基因内
背景:作为痴呆的前驱症状,轻度认知障碍（Mild cognitive impairment,MCI）可以通过积极有效的干预恢复正常。考虑到药物干预效果的不确定性,明确有效的非药物干预方法对维持或提高认知功能是极其重要的。在众多非药物干预措施中,运动锻炼近些年受到了越来越多的关注。相比于单一的运动项目,将多种运动项目结合的多模式运动对轻度认知障碍人群的干预效果更为显著。然而,目前依然缺乏专门针对中国
研究背景:组蛋白去甲基化酶突变或异常表达对于肿瘤的发生发展具有重要的影响。其中,KDM4蛋白在多种癌症中常常呈现高表达。作为去甲基化酶家族JMJD2/KDM4成员之一,KDM4B 能特异性地对 H3K9me3/me2、H3K36 me3/me2、H4K20me3及H1.4K26me3进行去甲基化,其表达受环境因素和细胞因子的调控,包括DNA损伤、激素以及缺氧等。已有研究表明KDM4B在乳腺癌、肺癌
目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是仅次阿尔茨海默症之后的第二大常见的神经退行性疾病。PD主要病理特征包括,大脑黑质致密部多巴胺神经元进行性丢失,α-突触核蛋白（α-synuclein）在神经元内异常聚集和路易小体形成。脑内ABCA1表达丰富,参与脑内胆固醇的转运。本文拟通过体外实验,研究ABCA1在α-突触核蛋白诱导的神经毒性中的作用及其可能机制。方法:采用SH-SY
细胞膜上的离子通道是生物体内许多重要生理活动的基础,离子通道的数目、结构和功能的变化往往会引起疾病的发生,因而近年来离子通道正逐渐成为许多药物研发的靶标。离子通道种类繁多,但就目前发现的结果而言,钾离子通道亚型最多、作用效果最复杂。它在多种生理过程中发挥着重要作用,比如调节神经元兴奋性,激素分泌,肌肉收缩,神经递质释放,心率调节,细胞增殖和细胞体积调节等。钾离子通道疾病的发生一般是由编码钾离子通道
目的肾脏纤维化是糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）重要的病理改变之一,其主要表现在纤维细胞的数量增加和细胞外基质的过度积聚。然而,线粒体裂变如何影响细胞外基质的积累尚不清楚。课题组前期研究发现:在系膜细胞中进行RCAN1.4过表达能诱导Drp1转位和线粒体碎裂,并促进细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）蛋白的积累,但具体机制尚不清楚,文献
温度是维持生命活动的重要因素,几乎影响鱼类所有的生理生化过程,进而对鱼类的一切生命活动造成影响。不同的鱼类都有其适宜生长的温度范围,当环境温度过低时,就会对鱼类产生不利的影响,如食欲减退、生长缓慢、代谢异常、免疫力下降等。当环境温度持续降低或低温胁迫的时间持续延长,则会造成鱼类的组织损伤,甚至导致鱼类死亡。目前许多养殖鱼品种都有不耐低温的特点,人工养殖对温度的要求比较严格。因此,研究鱼类对低温刺激
目的:随着物质生活水平提高,肥胖成为当今社会影响人民健康的重要因素之一。肥胖可以引起一系列代谢相关疾病,如糖尿病、高血压、高血脂等。研究发现,熊果酸（ursolic acid,UA）对肥胖及其相关代谢疾病有显著的抑制作用,但其具体分子机制仍然不清楚。本课题旨在建立高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型,观察熊果酸处理对肥胖小鼠体重、脂肪量、糖代谢及白色脂肪米色化的影响及其具体发生机制。以期解析熊果酸抗肥胖的发
目的:糖尿病是一种以高血糖为病理特征的代谢性疾病,可导致多种并发症的产生,其中中枢神经系统（central nervous system,CNS）性疾病,如缺血性中风、出血性中风、痴呆症和抑郁症的患病风险增加。血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）对维持CNS的环境稳定性至关重要,糖尿病所引发的CNS并发症可能与BBB功能障碍密切相关。人脑微血管内皮细胞（Human micro
目的:地塞米松已成为临床早产防治的常规用药之一。流行病学调查研究发现,地塞米松治疗所致的新生儿低出生体重与成年后多种慢性疾病的发生关系密切。动物研究也表明,孕期地塞米松暴露（prenatal dexamethasone exposure,PDE）可导致雌性子代生殖功能异常,卵巢储备减少。本室前期研究表明,PDE可引起胎鼠卵泡发育异常并可延续到F3代。本研究拟在整体动物水平观察PDE所致子代卵巢雌激