目的:糖尿病是一种以高血糖为病理特征的代谢性疾病,可导致多种并发症的产生,其中中枢神经系统（central nervous system,CNS）性疾病,如缺血性中风、出血性中风、痴呆症和抑郁症的患病风险增加。血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）对维持CNS的环境稳定性至关重要,糖尿病所引发的CNS并发症可能与BBB功能障碍密切相关。人脑微血管内皮细胞（Human microvascular endothelial cel,HBMEC）是血脑屏障的核心成分,长期高血糖可引起细胞发生氧化应激反应,导致HBMEC内活性氧类（Reactive Oxygen Species,ROS）大量累积并破坏HBMEC之间的紧密连接,进而影响BBB结构和功能,但其具体分子机制仍未完全明了。P66Shc是SHC家族的蛋白质衔接子,参与调节多种代谢途径,是促成线粒体ROS形成的蛋白之一。自噬是一种重要的细胞内降解途径,参与调节多种细胞行为。但是,高糖状态下,P66Shc是否通过ROS调节细胞的自噬水平进而影响BBB结构及功能的完整性,目前尚无报道。因此,本研究采用体外血脑屏障细胞模型-HBMEC为研究对象,探讨高糖导致的血脑屏障损伤的分子机制,以期为阐明高糖导致的神经系统损伤的分子机制提供重要的研究资料。方法:（1）建立体外HBMEC的高糖模型,检测高糖环境下HBMEC自噬、P66Shc及ROS水平:采用人脑微血管内皮细胞系HBMEC作为血脑屏障的体外细胞屏障模型,采用不同浓度（5.5m M,11m M,16.5m M,22m M,27.5m M）葡萄糖处理HBMEC,并选取最适糖浓度27.5 m M进行后续实验;分别在正常糖浓度（5.5m M）、高水平糖浓度（27.5m M）培养HBMEC 24小时后,采用Western blot检测HBMEC中自噬相关蛋白LC3、P62,BBB相关的紧密连接蛋白（zonula occludens protein-1,ZO-1）ZO-1,以及P66Shc和ROS的表达水平。透射电镜观察不同糖浓度下HBMEC中自噬小体的数目。免疫荧光染色观察HBMEC细胞表面紧密连接蛋白ZO-1的表达水平。（2）抑制线粒体ROS的产生对HBMEC之间紧密连接蛋白ZO-1和自噬的影响:高糖条件下给予Mito-TEMPO（线粒体ROS抑制剂,MT）干预线粒体ROS生成,免疫荧光染色检测HBMEC中ZO-1表达分布情况和ROS水平的变化;Western blot检测紧密连接相关蛋白ZO-1,以及自噬相关蛋白LC3和P62的表达水平;透射电镜检测不同分组条件下的HBMEC中自噬小体的形态及数量。（3）自噬激活或抑制对HBMEC中ZO-1的影响:使用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素（RAP）干预后,Western blot检测紧密连接蛋白ZO-1,以及自噬相关蛋白LC3I、LC3II和P62的表达水平;透射电镜检测不同分组条件下的HBMEC中双层膜的自噬小体的形态及数量。（4）沉默P66Shc对HBMEC自噬水平及细胞结构和功能的影响:利用si RNA沉默P66Shc,Real timePCR检测高糖条件下HBMEC中P66Shc的mRNA表达水平;Western blot检测高糖条件下HBMEC中ZO-1、LC3和P62的蛋白表达;免疫荧光染色观察沉默P66Shc后的HBMEC中ROS的变化。结果:（1）高糖增强HBMEC中自噬水平,且在27.5mM糖浓度时,细胞自噬水平升高最为明显,因此,后续实验以27.5mM糖浓度为高糖组。高糖可降低HBMEC中紧密连接蛋白ZO-1的表达、升高P66Shc及ROS的表达水平。（2）高糖状态下,抑制HBMEC中ROS水平,可逆转高糖诱导的细胞内高水平自噬、升高HBMEC中ZO-1的表达水平。（3）高糖状态下,HBMEC中自噬水平与ZO-1的蛋白表达负相关。（4）高糖状态下,干扰P66Shc的表达可降低细胞内ROS及自噬水平,升高ZO-1表达水平。结论:高糖可增强HBMEC自噬水平,破坏HBMEC之间紧密连接的完整性。沉默P66Shc可通过抑制ROS的产生和降低自噬,修复高糖所致HBMEC的损伤。