研究背景婴幼儿血管瘤,是一种最常见的先天性婴幼儿良性肿瘤。世界范围内的血管瘤的发病率为4%-5%,且呈逐年升高趋势。由于血管瘤会给患儿及家长带来的心理伤害,而且约10%血管瘤可出现呼吸道阻塞等各种并发症。因此,大部分血管瘤需要积极治疗,而且越早越好。手术治疗,激光治疗,冷冻治疗和口服或注射途径的药物治疗的疗效不一,副作用或并发症较多,有些还比较严重。普萘洛尔是一种常用于治疗高血压和其他疾病的β受体非选择性阻断药。大量临床研究证实普萘洛尔对血管瘤安全有效,已经成为治疗血管瘤的一线药物。HemangeolTM 口服溶液(盐酸普萘洛尔)已于2013年9月获得美国食品药品监督局(FDA)批准用于血管瘤。不过普萘洛尔引起的副作用仍不容忽视,包括症状性心动过缓等。另外,普萘洛尔每天需要服用两次,也降低了患者的依从性。因此,我们需要寻找新策略来减少普萘洛尔的毒副作用和服药次数。局部注射给药是一种可以直接靶向患病区域并达到理想浓度的给药方式,药物起效快,在其他正常器官组织分布少,毒副作用小。缓释给药系统是一种能实现对药物缓慢释放的给药系统,能在减少给药次数的同时延长药物的作用时间,能提高药物安全性和稳定血药浓度。因此,局部注射的缓释给药系统预期可以减少普萘洛尔的毒副作用和给药频率。脂质体和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)载体是两类典型的缓释给药系统。脂质体是一种具有单层或多层脂质双层的球形脂质囊泡,具有生物相容性好,易于表面修饰,技术简单等优点。然而,脂质体膜稳定性较差,药物容易发生泄漏,这也是制约脂质体临床应用的重要因素。PLGA微球是现今一种应用十分广泛的缓释给药系统,通过改变共聚单体比例,药物的时间释放范围可以从几周到几个月。因此,PLGA微球可以减少药物的给药次数,延长药物作用时间,提高药物安全性。研究人员发现,将脂质体负载于PLGA微球内制备成为脂质微球,能克服脂质体释放快的缺点,更好实现药物缓释和治疗效果。因此,在本研究中,我们设想将普萘洛尔负载于脂质体中,然后再将普萘洛尔脂质体包裹在PLGA微球中,构建一种负载普萘洛尔脂质体的PLGA微球(普萘洛尔脂质微球),以期实现对普萘洛尔的长效缓释,降低普萘洛尔给药次数和毒副作用,实现对血管瘤的安全有效的治疗。近期研究显示血管瘤干细胞是血管瘤发生发展的重要种子细胞,血管瘤干细胞具有多向分化潜能,具有连续血管瘤形成能力。因此,血管瘤干细胞是血管瘤形成的关键细胞,靶向杀伤血管瘤干细胞可以从根本上抑制血管瘤的增殖。CD133是一种5次跨膜糖蛋白,是多种干细胞的细胞表面标志物。研究发现CD133也是血管瘤干细胞的表面标志物。CD133阳性血管瘤干细胞能在免疫缺陷裸鼠中重新分化成为血管瘤;从CD133阳性血管瘤干细胞形成的血管瘤中重新分选出的CD133阳性血管瘤干细胞仍可以重新分化为血管瘤,即CD133阳性血管瘤干细胞具有连续血管瘤形成能力。因此,CD133阳性血管瘤干细胞是血管瘤的种子,靶向杀伤CD133阳性血管瘤干细胞可以从根本上抑制血管瘤的增殖。由于血管瘤干细胞特异性表达CD133,根据此特点,我们可以选择核酸适体来特异性靶向CD133。核酸适体是一种低分子量的寡聚核苷酸片段,能特异性靶向细胞表面蛋白抗原,由于核酸适体具有易合成和免疫原性低的特点,故而在分子靶向治疗中得到广泛应用。基于CD133核酸适体能特异性靶向CD133阳性血管瘤千细胞的特点,在本研究中,我们设想将构建一种负载普萘洛尔并修饰CD133核酸适体的纳米载体(CD133靶向普萘洛尔纳米载体),以期实现对血管瘤干细胞的特异性杀伤,另外,PLGA纳米载体还能同时实现对普萘洛尔的长期缓释,降低普萘洛尔给药次数和毒副作用,实现对血管瘤安全有效的治疗。研究方法(1)血管瘤内皮细胞和干细胞的分离和培养:从血管瘤病人切除下来的血管瘤标本存储在内皮细胞生长培养基中,4℃保存。然后将标本切成1 mm3大小组织块,然后利用胰蛋白酶消化后在内皮细胞生长培养基培养获得血管瘤内皮细胞。利用CD133磁珠分选血管瘤内皮细胞即得CD133阳性血管瘤干细胞。(2)普萘洛尔脂质微球和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的制备和表征①普萘洛尔脂质微球的制备:通过薄膜水合法制备普萘洛尔脂质体,然后通过挤出来获得粒径均一的普萘洛尔脂质体,通过凝胶过滤来从普萘洛尔脂质体中去除未包裹的普萘洛尔。然后将修饰后的脂质体分散到由溶解于乙酸乙酯中的聚乳酸聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚乳酸聚羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)的有机相中,通过涡旋混合,产生水/油乳液。将水/油乳液逐滴注入聚乙烯醇水溶液中并机械搅拌。将得到的水/油/水乳液倒入聚乙烯醇水溶液中,继续机械搅拌后挥发除去有机溶剂以形成固体微球,经洗涤和冷冻干燥后得到普萘洛尔脂质微球。②CD133靶向普萘洛尔纳米载体的制备:将普萘洛尔溶解在去离子水中,并且将羧基修饰的共聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇(PLGA-PEG-COOH)溶于二氯甲烷中。将普萘洛尔水溶液放在PLGA-PEG-COOH二氯甲烷溶液中乳化,用探针超声处理。将这种水/油乳液转移到聚乙烯醇水溶液中。在室温下温和搅拌所得的水/油/水乳液过夜蒸发有机相。将纳米载体离心并悬浮在去离子水中两次以纯化纳米载体。将溶液转移到聚乙烯醇水溶液中,并将混合物超声处理。然后通过碳化二亚胺法将CD133核酸适体连接在普萘洛尔纳米载体上,制备成为CD133靶向普萘洛尔纳米载体。③微球和纳米载体的纳米表征:通过Malvern Mastersizer 2000粒度分析仪测试微球的尺寸分布。通过Zetasizer Nano S分析纳米载体的粒径和电位。利用高效液相色谱仪测定微球和纳米载体的普萘洛尔包封率和载药量。④微球和纳米载体药物释放:将微球和纳米载体放置到截留分子量为1000道尔顿的透析膜中,然后将透析膜放入到含不同介质的烧杯中,然后将烧杯放在37℃水浴中,同时缓慢搅拌,在不同的时间点中,取少量的透析液用高效液相色谱来测定透析液中普萘洛尔的含量。(3)CD133靶向普萘洛尔纳米载体对血管瘤干细胞的靶向性:将血管瘤干细胞接种在细胞培养板中,然后载荧光素的CD133靶向纳米载体或CD133靶向普萘洛尔纳米载体和血管瘤干细胞孵育4小时后,然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞后,用流式细胞术进行分析细胞荧光,或者用细胞裂解液裂解细胞,用高效液相色谱的方法来检测细胞中普萘洛尔的含量。(4)普萘洛尔脂质微球和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的体外细胞毒性和对细胞因子分泌的影响:将血管瘤干细胞和内皮细胞接种在细胞培养板中并培养过夜后,然后加入普萘洛尔脂质微球和CD133靶向普萘洛尔纳米载体后,利用细胞增殖试剂盒检测药物对细胞增殖影响,同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测药物对细胞中血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGF-A)和碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的影响。(5)普萘洛尔脂质微球和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的体内抗血管瘤作用和机制:从血管瘤病人切除下来的血管瘤标本在内皮细胞生长培养基中培养出血管瘤干细胞后,将血管瘤干细胞重悬于Matrigel基质胶中,然后皮下接种于雌性裸鼠的侧腹,等待血管瘤体积达到25 mm3后,瘤内注射普萘洛尔脂质微球或CD133靶向普萘洛尔纳米载体,在不同时间点观察血管瘤体积变化,以评估体内抗血管瘤作用;治疗结束后处死裸鼠,对血管瘤重量进行称量,对血管瘤组织进行伊红-苏木精染色和微血管密度评估。同时检测裸鼠体重变化以明确药物治疗的体内毒性。研究结果(1)普萘洛尔脂质微球和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的制备和表征:普萘洛尔脂质微球的粒径为77.8 μm,多分散系数为0.26,普萘洛尔的包封率为23.9%,该包封率要低于普萘洛尔脂质体(40.8%),原因是因为微球不能包封所有脂质体。药物释放实验显示:第1天仅释放8%普萘洛尔,第4天释放35%,第20天普萘洛尔的释放达到平台75%。普萘洛尔脂质微球在含血清磷酸盐缓冲液中的药物释放较磷酸盐缓冲液较快,表明血清可能在一定程度上使普萘洛尔脂质微球变得不稳定。CD133靶向普萘洛尔纳米载体的粒径为143.7 nm,多分散系数为0.16,粒径分布均一,ζ电势低于-20mv。透射电镜显示:CD133靶向普萘洛尔纳米载体的粒径均一,而且相对光滑。CD133靶向普萘洛尔纳米载体的包封率为51.8%,载药量为6.2%。药物释放实验显示:CD133靶向普萘洛尔纳米载体在最初48小时内能快速释放普萘洛尔(在磷酸盐缓冲液中的释放为40%,在含血清PBS中的释放为55%)。在接下来的144小时中,纳米载体的普萘洛尔累积释放在PBS中达到约70%,在含有血清的磷酸盐缓冲液中达到约85%。(2)CD133靶向普萘洛尔纳米载体对血管瘤干细胞的靶向性:载荧光素的CD133靶向纳米载体的平均荧光强度显著高于载荧光素的纳米载体处理组,如果用过量的CD133核酸适体处理细胞后,载荧光素的CD133靶向纳米载体的平均荧光强度显著降低,这表明载荧光素的CD133靶向纳米载体和血管瘤干细胞的结合归因于CD133核酸适体。另外,CD133靶向普萘洛尔纳米载体在血管瘤干细胞中的内吞率为67%,明显高于普萘洛尔(8%)和普萘洛尔纳米载体(26%),用过量的CD133核酸适体处理细胞后,CD133靶向普萘洛尔纳米载体的普萘洛尔内吞率显著降低,这表明CD133靶向普萘洛尔纳米载体和血管瘤干细胞的结合归因于CD133核酸适体。(3)普萘洛尔脂质微球和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的体外细胞毒性和对细胞因子分泌的影响:普萘洛尔,普萘洛尔脂质体和普萘洛尔脂质微球的72小时IC50值分别为110.5,120.8和379.3 μM,表明普萘洛尔脂质体显示出与普萘洛尔相似的细胞毒性作用,普萘洛尔脂质微球毒性比普萘洛尔要差3.4倍),普萘洛尔,普萘洛尔脂质体和普萘洛尔脂质微球的120小时IC50分别为40.8,56.5和120.7 μM(表明普萘洛尔脂质体显示与普萘洛尔相似的细胞毒性,普萘洛尔脂质微球毒性比普萘洛尔要差2.95倍)。在普萘洛尔浓度范围为30-500 μ M时,普萘洛尔和普萘洛尔脂质体在抑制VEGF-A mRNA表达方面比普萘洛尔脂质微球更有效。例如,在500 μM时,普萘洛尔和普萘洛尔脂质体对VEGF-AmRNA表达的抑制率为80%,而相同浓度的普萘洛尔脂质微球仅为40%。同样,在普萘洛尔浓度范围为30-500 μM时,普萘洛尔和普萘洛尔脂质体在抑制VEGF-A蛋白表达方面比普萘洛尔脂质微球更有效。同样的,普萘洛尔和普萘洛尔脂质体比普萘洛尔脂质微球更有效抑制bFGF的表达。在血管瘤干细胞中,普萘洛尔,普萘洛尔纳米载体和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的72小时IC50值分别为83.2,97.6和35.8 μM,表明普萘洛尔和普萘洛尔纳米载体具有相似的细胞毒性作用,但是CD133靶向普萘洛尔纳米载体的毒性要比普萘洛尔强2.7倍。普萘洛尔,普萘洛尔纳米载体和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的120小时IC50值分别为63.5,78.7和16.9 μM,表明普萘洛尔和普萘洛尔纳米载体具有相似的细胞毒性作用,但是CD133靶向普萘洛尔纳米载体的毒性要比普萘洛尔强3.8倍。普萘洛尔,普萘洛尔纳米载体和CD133靶向普萘洛尔纳米载体均能剂量依赖性抑制血管瘤干细胞的VEGF-A和bFGF mRNA和蛋白的表达,CD133靶向普萘洛尔纳米载体较普萘洛尔更能有效的抑制VEGF-A和bFGF mRNA和蛋白的表达。例如,在500 μM时,普萘洛尔和普萘洛尔纳米载体抑制VEGF-A mRNA表达约60%,而CD133靶向普萘洛尔纳米载体的抑制率为80%。在500 μM时,普萘洛尔和普萘洛尔纳米载体对VEGF-A蛋白表达的抑制率为65%,而CD133靶向普萘洛尔纳米载体的抑制率为90%。(4)普萘洛尔脂质微球和CD133靶向普萘洛尔纳米载体的体内抗血管瘤作用机制:我们接下来检查了普萘洛尔,普萘洛尔脂质体和普萘洛尔脂质微球对血管瘤的小鼠体内治疗效果。在第35天时,普萘洛尔脂质微球治疗导致血管瘤体积减少84%,而普萘洛尔脂质体和普萘洛尔治疗分别仅导致血管瘤体积减少44%和13%。普萘洛尔脂质微球治疗组的血管瘤体积明显小于其他组(生理盐水组:215mm3,普萘洛尔组:187 mm3,普萘洛尔脂质体组:121 mm3,普萘洛尔脂质微球组:35 1mm3)。普萘洛尔脂质微球治疗组的平均血管瘤重量显著低于其他组(生理盐水组:0.28 g,普萘洛尔组:0.21 g,普萘洛尔脂质体组:0.13 g,普萘洛尔脂质微球组:0.03 g)。另外,通过观察处理后的任何行为变化并通过监测小鼠体重来测量所有处理的毒性。结果显示,所有的治疗都具有血管瘤小鼠的良好耐受性。与盐水对照组相比,所有经处理的小鼠没有显示出任何显著行为改变并且体重没有显著变化,这表明普萘洛尔,普萘洛尔脂质体和普萘洛尔脂质微球不引起小鼠明显的行为改变并且对小鼠体重没有不利影响。在实验结束时,血管瘤用苏木精和伊红染色,并进行组织切片的微血管密度分析。普萘洛尔脂质微球治疗组的平均微血管密度显著低于其他组,提示普萘洛尔脂质微球能显著抑制血管瘤的血管生成。我们接下来检查了普萘洛尔,普萘洛尔纳米载体和CD133靶向普萘洛尔纳米载体对小鼠的血管瘤治疗效果。在治疗终点时,和生理盐水治疗组相比,CD133靶向普萘洛尔纳米载体治疗导致血管瘤体积减少76%,而普萘洛尔纳米载体和普萘洛尔治疗仅导致血管瘤减少57%和34%体积。CD133靶向普萘洛尔纳米载体治疗组的血管瘤体积显著小于其他组组(生理盐水组:256 mm3,普萘洛尔组:169mm3,普萘洛尔纳米载体组:110 mm3,CD133靶向普萘洛尔纳米载体组:62 mm3)。而且,CD133靶向普萘洛尔纳米载体治疗后的血管瘤称重要显著低于其他组(生理盐水组:0.26g,普萘洛尔组:0.18g,普萘洛尔纳米载体组:0.11g,CD133靶向普萘洛尔纳米载体组:0.05 g)。通过观察治疗后的任何行为改变和通过监测来测量所有治疗的毒性小鼠体重。结果显示,普萘洛尔纳米载体和CD133靶向普萘洛尔纳米载体不引起小鼠显著的行为改变,并且对小鼠的体重没有不利影响。在实验结束时,血管瘤用苏木精和伊红染色,并进行组织切片的微血管密度分析。与生理盐水注射相比小鼠,普萘洛尔显著抑制血管瘤血管形成。CD133靶向普萘洛尔纳米载体治疗组的血管密度显著低于其他组(生理盐水组:68血管/mm2,普萘洛尔组:40个血管/mm2,普萘洛尔纳米载体组:27个血管/mm2,CD133靶向普萘洛尔纳米载体组:13个血管/mm2),表明CD133靶向普萘洛尔纳米载体对抑制血管瘤的血管化是最有效的。研究结论普萘洛尔脂质微球实现了实现对普萘洛尔的长效缓释,降低普萘洛尔给药次数和毒副作用,实现对血管瘤的安全有效的治疗。CD133靶向普萘洛尔纳米载体实现对血管瘤干细胞的特异性杀伤,同时还实现对普萘洛尔的长期缓释,降低普萘洛尔给药次数和毒副作用,实现对血管瘤的安全有效的治疗。该研究该研究首次利用脂质体微球和血管瘤干细胞靶向纳米载体的新策略实现普萘洛尔缓释和靶向血管瘤干细胞,为血管瘤治疗提供新思路。该研究可为能血管瘤治疗提供两种高效低毒的新型抗血管瘤药物递送载体。