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目的： 深部真菌感染已严重威胁人类健康;白念珠菌是人类深部真菌感染最常见的病原菌之一。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1; HMGB1)在白念珠菌感染中起着十分重要的作用;但其发生发展机制尚不明确。microRNA (miRNAs)是一类内源性保守的小分子非编码RNA;在炎症反应的表达及释放中起着重要的调控作用。目前;在白念珠菌感染时调控HMGB1的miRNAs;尚罕见报道。本研究拟进行白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬细胞;分析 miRNAs 的表达谱变化;进一步筛选并验证调控 HMGB1 的 miRNAs;以探讨 miRNAs 在白念珠菌感染时对HMGB1的调控作用;为白念珠菌感染的诊断及治疗提供新思路。 方法： 1. 提取小鼠原代腹腔巨噬细胞;用光学显微镜观察巨噬细胞形态;台盼蓝染色观察细胞存活率;Wright-Giemse染色和流式细胞仪检测细胞纯度;吞墨实验和吞酵母菌实验检测巨噬细胞吞噬功能。 2. 灭活白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬细胞的最佳浓度及时间点的筛选：用PBS液;灭活白念珠菌悬液(3×106、1.5×107、3×107和3×108cfu/mL)分别刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞;在24h、36h和48h;分别用Western blot检测HMGB1蛋白的表达水平。 3. 筛选并分析白念珠菌感染时miRNAs差异表达谱：用最适浓度的灭活白念珠菌悬液刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞于最佳时间点; miRNAs 基因芯片筛选差异表达的 miRNAs;qRT-PCR 验证基因芯片的可靠性。 4. 采用 12 个 miRNAs 生物信息学软件预测差异表达的 miRNAs所调控的靶基因;进行生物信息学 GO(gene ontology)富集分析和Pathway分析。 5. 构建HMGB1 3-UTR区表达载体及突变载体;双荧光素酶报告基因验证mmu-miR-146b-5p与HMGB1是否直接作用。 6. 验证白念珠菌感染时 mmu-miR-146b-5p 对 HMGB1 的调控作用：用白念珠菌刺激转染mimic NC、mmu-miR-146b-5p mimic、inhibitor NC和mmu-miR-146b-5p inhibitor的小鼠原代腹腔巨噬细胞;qRT-PCR验证mmu-miR-146b-5p的转染效率;qRT-PCR、Western blot和ELISA检测HMGB1在细胞中mRNA、蛋白和上清中的表达变化;激光共聚焦显微镜观察HMGB1在细胞中的活性及转位情况。 7. 检测相关炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor ecrosis factor-α;TNF-α)和白介素-6(interleukin-6 ; IL-6)的表达水平：实验分为 normal、C.albicans、mimic NC、mmu-miR-146b-5p mimic、inhibitor NC和mmu-miR-146b-5p inhibitor组;ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-6蛋白的表达水平。 8. 检测关键炎症信号通路核转录因子 κB(nuclear factor-kappab; NF-κB)表达变化：实验分为normal、C.albicans、mimic NC、mmu-miR-146b-5p mimic、inhibitor NC和mmu-miR-146b-5p inhibitor组;Western blot 检测各组细胞中 NF-κB p65 蛋白的表达水平;激光共聚焦显微镜观察NF-κB p65在细胞中的活性及转位情况。 结果： 1. 光学显微镜显示巨噬细胞生长状况良好;台盼蓝染色显示细胞存活率高达92%;Wright-Giemse染色显示符合巨噬细胞形态;流式细胞仪显示巨噬细胞纯度高达96.7%;吞墨实验显示巨噬细胞吞墨比率为95%;吞酵母菌实验显示巨噬细胞吞酵母菌比率为97%。 2. 白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬细胞的最适浓度为1.5×107cfu/mL;最佳时间点为36h。 3. miRNAs 基因芯片筛选出白念珠菌感染时有 222 个差异表达miRNAs;当筛选条件为FC≥1.5;P＜0.05时;差异表达miRNAs有21个;其中上调有7个miRNAs;下调有14个miRNAs;qRT-PCR证实miRNAs基因芯片结果可靠。 4. GO富集分析显示;上调和下调的miRNAs预测的多个靶基因;在生物进程中;均参与细胞应答、信号转导、细胞蛋白质氨基酸磷酸化和促进NF-κB由胞浆到胞核转位的生物学功能;在分子功能中;均参与蛋白、核酸和离子等结合能力;在细胞组分中;均可能定位于细胞的胞核、胞膜和胞质中。Pathway分析和网络调控图显示;上调和下调的miRNAs预测的多个靶基因均可能参与炎症密切相关的NF-κB信号通路。 5. 成功构建HMGB1 3-UTR区表达载体及突变载体;双荧光素酶报告基因检测表明mmu-miR-146b-5p可直接调控靶基因HMGB1。 6. qRT-PCR 表明 mmu-miR-146b-5p 转染效果良好;qRT-PCR、Western blot和ELISA结果均提示mmu-miR-146b-5p可有效负调控靶基因HMGB1的mRNA和蛋白的表达水平;差异均有统计学意义(P＜0.05);激光共聚焦显微镜结果提示;mmu-miR-146b-5p 可有效负调控白念珠菌感染时细胞中HMGB1由胞核到胞浆的转位。 7. ELISA结果显示;mmu-miR-146b-5p可有效负调控白念珠菌感染时上清中炎性细胞因子TNF-α和IL-6蛋白的表达水平;差异均有统计学意义(P＜0.05)。 8. Western blot结果显示;mmu-miR-146b-5p可有效负调控白念珠菌感染时细胞中 NF-κB p65 蛋白的表达水平;激光共聚焦显微镜结果表明mmu-miR-146b-5p可有效负调控NF-κB由胞浆到胞核的转位。 1. 本实验成功提取了小鼠原代腹腔巨噬细胞;并确定灭活白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬细胞的最适浓度为1.5×107cfu/mL;最佳时间点为36h。 2. miRNAs基因芯片成功筛选出21个差异表达的miRNAs;qRT-PCR验证芯片可靠。 3. GO和Pathway分析;发现差异表达的miRNAs预测的靶基因可能参与多种生物学功能以及多条信号通路;其中可能参与炎症密切相关的NF-κB信号通路。 4. 本实验成功筛选到差异表达的mmu-miR-146b-5p;在白念珠菌感染时可直接调控靶基因HMGB1;并抑制HMGB1的表达及转位;减少炎性细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的表达水平;同时参与了炎症相关的NF-κB信号通路。