目的:　　脑血管疾病是死亡率较高的的三大疾病之一。在脑缺血后，高迁移率族蛋白-1(HMGB1)释放增多，血管内Toll样受体被激活，进而导致氧化应激，使非受体酪氨酸蛋白激酶-Src家族激酶活性急剧增高，增加血管内皮渗透性。另一面，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可以导致线粒体NADPH氧化酶4(NOX4)活化，促进NOX4产生活性氧，激活Src家族激酶，也增加血管内皮渗透性。从氧化应激、Src活化和内皮渗透性的角度讲，大鼠缺血再灌注损伤过程可能与AngⅡ通路有相似之处，本文首先通过蛋白质免疫印迹法筛选出能有效抑制Src家族激酶的中药单体，并进一步验证具有Src家族激酶抑制剂类作用且在修复血脑屏障(BBB)损伤、维持BBB稳定性的同时还能发挥内皮细胞保护作用的中药单体-异补骨脂二氢黄酮在体内、体外的作用，同时对其保护大鼠脑缺血再灌注损伤的机制进行研究，以揭示该药物对脑缺血再灌注损伤的保护与线粒体氧化应激之间的关系。　　方法:　　1.用100nmol/L AngⅡ刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)0，1，2，5，7，9，11min，构建体外氧化应激模型，Western Blot法确定激活Src家族激酶活性的最佳时间点。　　2.在该最佳时间点下，Western Blot法从23种中药化合物中筛选能有效抑制Src家族激酶活性的药物。　　3.以HUVEC为研究对象，100nmol/L AngⅡ刺激7min，异补骨脂二氢黄酮(Isobavachin，IBA)干预后，Western Blot法验证不同浓度(3.125，6.25，12.5，25，50μmol/L)的IBA对HUVEC中Fyn蛋白活性的影响;运用ADP-GloTM激酶检测试剂盒检测不同浓度(0.016，0.08，0.4，2，10，50，250μmol/L) IBA对AngⅡ诱导HUVEC中Src家族激酶活性的直接作用，并计算IC50。　　4.120只SD大鼠240-270g随机区组分为假手术(Sham)组、模型(Vehicle)组、IBA高剂量(100μg/kg)组、中剂量(50μg/kg)组、低剂量(25μg/kg)组、Src家族激酶阻断剂PP2组(30μg/kg)。每组20只，模型及给药组采用线栓法造大鼠脑中动脉梗塞再灌注模型(Middle Cerebral Artery Occlusion/Reparation，MCAO/R)，造模后，舌下静脉给生理盐水，IBA以及PP2(0.1％DMSO)，梗塞1h，再灌注24h。并对再灌注前及处死前神经功能缺失进行评分，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色由梗死体积的面积确定最佳给药剂量。　　5.以大鼠MCAO模型血脑屏障内皮细胞为研究对象，Western Blot法、免疫组化及免疫荧光法检测再灌注不同时间点0，1，6，12以及24h对血脑屏障中Src家族激酶蛋白的活性以及连接蛋白的表达影响，确定最佳时间点。在再灌注最佳时间点下，Western Blot法、免疫组化及免疫荧光法检测IBA对Src家族激酶蛋白活性以及连接蛋白的表达影响。最后，用激光散斑血流成像仪检测脑血流量的变化。　　6.用50μmol/L的IBA作用于HUVEC2小时后，装载Mito Tracker Green和MitoSOXTM Red荧光探针，检测100nmol/L AngⅡ刺激前后的荧光量，反映线粒体活性氧(ROS)的生成量。线栓法造大鼠MCAO模型，造模后舌下静脉给线粒体超氧阴离子清除剂mito-Tempo(200μg/kg)，检测其对大鼠脑缺血再灌注神经功能缺失以及梗死体积的变化情况，最后Western Blot法检测再灌注6h其对血脑屏障内皮细胞中Src家族激酶的影响。　　结果:　　1.100nmol/L AngⅡ刺激HUVEC，Src家族激酶磷酸化被激活，且在7min时，Src、Fyn蛋白的磷酸化水平最高。　　2.100nmol/L AngⅡ刺激HUVEC7min，结果表明异补骨脂素、补骨脂定、补骨脂黄酮、IBA、光甘草宁对Src、Fyn蛋白的活性有明显的抑制作用。经过药物复筛，最终选择IBA作为后续的实验研究。　　3.用100nmol/L AngⅡ刺激HUVEC7min，随着IBA浓度的升高，Fyn蛋白磷酸化表达逐渐降低;且IBA对Src激酶重组蛋白活性有直接抑制作用，呈浓度依赖性，IC50为17.286μmol/L。　　4.在大鼠MCAO模型中，与模型组相比，IBA高、中两个剂量组及PP2组在处死前神经功能缺失评分均有不同程度降低，且有显著差异。与模型组相比，IBA高、中两个剂量组及PP2组能明显减少脑梗死灶，最终确定最佳给药剂量为50μg/kg。　　5.大鼠血脑屏障内皮细胞中Src家族激酶蛋白磷酸化水平在再灌注6h时表达最高，相反，连接蛋白在再灌注6h表达最低。因此，选择给药处理6h。发现与模型组相比，IBA可以降低脑微血管内皮细胞中Src家族激酶的活性，促进连接蛋白的表达。激光散斑血流成像仪测得模型组和IBA组脑血流量在缺血1h时左边血流量显著低于右边，表明造模成功。模型组在再灌后10-120min内，左边血流量急剧上升，且血流量显著高于右边脑血流量。而IBA组在再灌后2h内左边脑血流缓慢上升，最后左右两边脑血流量趋于一致。说明IBA能降低脑血流在再灌后的急剧上升，降低血管的渗透性。　　6.IBA减少AngⅡ刺激后线粒体ROS的生成量，即能抑制线粒体氧化应激。且mito-Tempo及NAC也能抑制线粒体氧化应激，说明IBA具有mito-Tempo相似作用。mito-Tempo能明显降低大鼠MCAO模型神经功能缺失评分，并能减少梗死体积。在再灌注6h时，mito-Tempo使血脑屏障内皮细胞中Src家族激酶活性降低。　　结论:　　本课题我们利用AngⅡ刺激HUVEC，导致NADPH氧化酶产生细胞浆内活性氧(ROS)。而ROS激活下游信号蛋白Src家族激酶(SFKs)，同时促发线粒体氧化应激通路。在细胞水平的实验中，发现中药补骨脂活性成分异补骨脂二氢黄酮(IBA)不仅能调控SFKs磷酸化水平，亦能直接抑制Src激酶活性。在体内实验中，发现IBA对MCAO模型大鼠有一定抗脑缺血作用，也能降低SFKs活性，阻止细胞间紧密连接蛋白的降解，从而保护血脑屏障内皮通透性。体内实验也观察到线粒体ROS参与激活SFKs活性和内皮渗透性，而IBA能有效地抑制线粒体ROS。线粒体内氧化应激清除剂mito-Tempo在体内的实验中保护大鼠MCAO模型血脑屏障的内皮，减轻损伤，说明IBA对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护是通过线粒体氧化应激和SFKs来实现的。