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双酚A(Bisphenol A, BPA)是环氧树脂的组成部分,用于生产食品和饮料容器。BPA是一种常见的内分泌干扰物(EDCs),由于结构式和己烯雌酚(DES)相似,以往研究BPA对人体生理和毒理的影响主要集中在它的雌激素效应。BPA可以从盛装食品和饮料的塑料容器中渗出,因此容易影响男性和女性生殖系统的正常发育和功能。除了对生殖器官的毒性作用,近年来还发现BPA对大脑发育和行为有不良影响。BPA能改变中枢神经系统(CNS)神经元的形态和功能。比如BPA抑制雌二醇(E2)对海马CA1区突触发生的促进作用并且消除E2诱导的长时程增强(Long-term potentiation, LTP)。除了经典的慢性雌激素作用,即通过调节核的基因转录,BPA还可以经膜上的雌激素受体(ER)独立于基因的转录作用(快速的非基因组效应)。神经系统中快速非基因组效应常常是经NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptors)介导的细胞内Ca2+信号网络在突触可塑性中发挥一定功能,如神经递质的释放和LTP的诱导等。NMDA受体介导的Ca2+内流对神经细胞的分化、迁移、突触形成、突触重建、LTP和LTD (long-term depression)以及学习、记忆等的认知功能必不可少。在树突棘中,NMDA受体介导的Ca2+信号并不是静态的,而是可以受到细胞突触NMDA受体亚基组成的具体方式、蛋白激酶和神经元的活动的调节并做出一定的应答。一些研究证据表明,通过NMDA受体和L-型电压门控Ca2+通道介导的Ca2+的改变能够长期影响海马神经元内在的可塑性变化。最近的证据表明,NMDA受体介导的细胞内Ca2+信号和NMDA受体依赖的LTP的诱导有关,并有可能受到ERK1/2信号激酶的调节。但BPA是否影响Ca2+变化及上游信号通路尚不明白,在目前的研究中,关于低剂量(纳摩尔水平)BPA在海马神经元胞内调节Ca2+的快速效应还很少。研究内容：不同浓度BPA对谷氨酸(Glu)刺激海马神经元[Ca2+]i增多的影响；利用ER拮抗剂IC1182 780及雄激素受体(AR)拮抗剂Flutamide确定BPA引起[Ca2+.]i变化是否经ER或AR介导;此外,利用MAPK/ERK1/2激酶抑制剂U0126和MAPK/p38 MAPK抑制剂SB203580预处理并通过检测ERK1/2及p38蛋白及其磷酸化表达水平改变,探究BPA引起的[Ca2+]i变化是否由ERK1/2及p38信号通路介导。研究方法：出生后24 h内分离的大鼠海马神经元,培养8-10天后,先用钙荧光探针Fluo 4-AM负载30 min之后进行药物处理。BPA的最终浓度分别为1、10、100和1000 nM；接着检测17p-雌二醇(17β-E2)和双氢睾酮(DHT)对海马神经元[Ca2+]i的影响；再分别采用ER和AR拮抗剂IC1182780和Flutamide预处理探究BPA引起[Ca2+]i增加是否经由ER或者AR介导；然后用ERK1/2激酶抑制剂U0126和p38 MAPK抑制剂SB203580预处理检测BPA对[Ca2+]i的影响；另外,Western bolt检测ERK1/2和p38 MAPK表达水平。研究结果：1、脑内重要的兴奋性氨基酸Glu被用来作为Ca2+内流的触发剂。未加Glu前,Ca2+的基础荧光值几乎不变,加入Glu后荧光瞬时增强,之后Ca2+荧光保持在一定水平。根据实验结果,在接下来的实验中利用Glu刺激[Ca2+]i变化。2、为了探究BPA是否改变神经元[Ca2+]i,本实验检测了BPA处理30 min后Glu诱导的Ca2+的变化。结果表明：BPA处理30 min后,Glu诱导的神经元[Ca2+]i比对照组显著增加了46%(P<0.001)。对于不同浓度的BPA,我们发现1、10、100 nM的BPA能促进Glu诱导的[Ca2+]i增加,且10 nM BPA的促进作用更为明显。然而1000 nM BPA却抑制了Glu诱导的[Ca2+]i(P<0.01)。3、检测17p-E2(1、10、100 nM)和DHT(1、10、100 nM)对Glu诱导的[Ca2+]i的影响。结果表明,10 nM的17β-E2和10 nM的DHT对[Ca2+]i影响最显著(P<0.01)。另外还发现,10 nM BPA增加[Ca2+]i的程度类似于17β-E2(10nM)和DHT(10 nM)。4、探讨BPA引起[Ca2+]i的变化是否经ERs和AR介导。结果表明,IC1182780和Flutamide能够完全消除BPA对[Ca2+]i的促进作用,ICI182780或Flutamide单独应用时[Ca2+]i与对照组无异。为了进一步证明ERs和AR介导了BPA对[Ca2+]i的影响,将17β-E2或DHT与BPA共同处理,结果显示17β-E2、DHT、BPA的促进作用都被消除。5、ERK1/2抑制剂U0126预处理拮抗了Glu诱导的神经元[Ca2+]i上升,BPA不能逆转U0126预处理后神经元[Ca2+]i对Glu响应的抑制作用,但BPA预处理却部分拮抗U0126对Glu诱导的神经元[Ca2+]i升高的拮抗作用。p38MAPK抑制剂SB203580能够显著抑制BPA对由Glu诱导的神经元[Ca2+]i升高。另外BPA显著上调p-ERK1/2和p38及p-p38表达(P<0.01)结论：1、10、100 nM BPA对Glu诱导的[Ca2+]i有促进作用,但1000 nM时BPA显著降低[Ca2+]i(P<0.01),表明BPA存在低浓度促进高浓度抑制的效应。性激素受体拮抗剂预处理消除了BPA对[Ca2+]i的促进作用,提示BPA对Glu诱导的[Ca2+]i的影响依赖ERs和AR。此外,BPA可以上调p-ERK和p38及p-p38的表达,说明BPA快速增加[Ca2+]i可以通过ERK1/2和p38MAPK信号通路介导。