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苦荞(Fagopyrum tatarium)是一种药食两用植物,不仅具有丰富的营养,而且富含以芦丁为代表的黄酮醇类化合物。黄酮醇合成是植物苯丙烷代谢途径的支路之一,在黄酮醇合酶(Flavonols synthetase, FLS)的催化下,二氢槲皮素(Dihyquercetin, DHQ)、二氢山奈酚(Dihykaempferol, DHK)和二氢杨梅素(Dihydromyricetin, DHM)等3种二氢黄酮醇可转化为槲皮素、山奈酚和杨梅素等3种黄酮醇,其中槲皮素经糖基化后转变为芦丁。已有研究表明,苦荞FtFLS基因在染色体上存在多拷贝,预示具有不同的FtFLS同源蛋白参与了苦荞芦丁的合成。本研究基于苦荞花期转录组数据,克隆了苦荞黄酮醇合酶同源蛋白的两条基因FtFLS2和FtFLS3,并进行生物信息学分析：实现其在大肠杆菌中的表达,比较了FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3等3个重组苦荞黄酮醇合酶对3种底物的动力学参数,分析了它们在苦荞芦丁合成中的最适底物。本研究取得了以下主要结果：1.采用同源克隆和RACE技术,获得2条苦荞黄酮醇合酶同源基因的ORF序列,命名为FtFLS2和FtFLS3。序列分析表明,FtFLS2的ORF为996 bp,编码331个氨基酸残基的蛋白,推导的FtFLS2蛋白相对分子量为37.8 KDa,分子式为C1771H2651N4510502S10,pI为5.52；FtFLS3的ORF为1008 bp,编码335个氨基酸残基的蛋白,推导的FtFLS3蛋白相对分子量为38.1 KDa,分子式为C1723H2689N449O509S10,pI为5.74。Blast分析表明,FtFLS2和FtFLS3与已知的FtFLS1(GenBank ID:JX401285.1)的相似性分别为97%和77%。多重序列比对显示,FtFLS2和FtFLS3含有2-ODD家族蛋白的保守功能区Conserved domain A、Conserved domain B、Fe2+离子结合位点和2-酮戊二酸结合位点,属于典型的2-酮戊二酸依赖型的双加氧酶。同源进化树分析表明,FtFLS2与葡萄(Vitis vinifera)的VvFLS (GenBank ID:AB213566)聚为簇Ⅲ,FtFLS3与FtFLS 1和甜荞(Fagopyrum esculentum)FeFLS聚为簇Ⅰ,推测它们可能具有不同的催化特征。2.构建FtFLS2和FtFLS3的原核表达载体pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3,并在大肠杆菌中实现的可溶性表达。SDS-PAGE分析表明,重组FtFLS2和FtFLS3蛋白分子量分别为37.8 KDa和38.1 KDa。pET30-FtFLS2和pET30-FtFLS3,及本课题组已获得的基因工程菌pET30-FtFLSl,均置于1 mmol/L IPTG,25℃条件下,诱导10 h。菌体经超声波破碎,镍亲和层析,获得电泳纯FtFLS1、FtFLS2和FtFLS3重组蛋白。薄层层析(TLC)分析表明,3个FtFLS均具有将DHQ转化为槲皮素的活性。在100μmol/L DHQ的反应液中,12.5μg的三种FtFLS蛋白均在15min内催化生成的槲皮素量与反应时间呈直线相关。采用双倒数作图法,测定3个重组FtFLS对DHQ、 DHK和DHM的酶促反应动力学参数,结果显示：对3种二氢黄酮醇的米氏常数,FtFLS 1分别为KmDHQ=594.17μmol/L (VmaxDHQ=42.55 μmol/L-min),KmDHK=1257.18 μmol/L (VmaxDHQ= 25.53 μmol/L-min)和=1516.36 μmol/L (VmaxDHM=17.76 μmol/L-min); FtFLS2分别为KmDHQ=8411.27μmol/L (VmaxDHQ= 10.25 μmol/L-min), K= 23646.74 μmol/L (VmaxDHQ-13.59 μmol/L-min)和KmDHM=21583.23μmol/L (VmaxDHM=12.15μmol/L·min);FtFLS3分别为KmDHQ=6478.21μmol/L(VmaxDHQ=13.97 μmol/L-min), KmDHK=717.93 μmol/L (VmaxDHQ=24.04 μmol/L-min)和KmDHM=1609.36 μol/L (VmaxDHM=17.83 μmol/L-min)。分析表明,FtFLS 1和FtFLS2的最适底物均为DHQ, FtFLS3的最适底物为DHK。以上研究结果,加深了对苦荞黄酮醇合成支路代谢流向和流量的认识。