【摘 要】
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【目的】研究p202对MCMV感染巨噬细胞内AIM2炎性体通路相关分子及其下游分子表达的影响,以探讨其对MCMV复制的作用及其是否参与病毒逃避宿主免疫反应的分子机制。【方法】1.MCMV感染后p202转录及蛋白表达水平:（1）MCMV分别感染小鼠巨噬细胞J774A.1细胞和RAW264.7细胞,感染复数（multiplicity of infection,MOI）为1,并同时设置模拟感染对照组,在
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【目的】研究p202对MCMV感染巨噬细胞内AIM2炎性体通路相关分子及其下游分子表达的影响,以探讨其对MCMV复制的作用及其是否参与病毒逃避宿主免疫反应的分子机制。【方法】1.MCMV感染后p202转录及蛋白表达水平:（1）MCMV分别感染小鼠巨噬细胞J774A.1细胞和RAW264.7细胞,感染复数（multiplicity of infection,MOI）为1,并同时设置模拟感染对照组,在MCMV感染后12h收集细胞,分别提取细胞总RNA和总蛋白;（2）建立小鼠播散性MCMV感染模型（注射方式:腹腔注射MCMV Smith毒株,注射剂量:1.0×10~4PFU/只）,并设立模拟感染对照组（腹腔注射等体积DMEM培养基）,在感染后1d、3d、7d和14d,每组每个时间点随机处死3只小鼠,留取唾液腺组织,提取组织总RNA和总蛋白;（3）采用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测p202 m RNA水平;采用Western Blot法检测p202蛋白水平。细胞模型样本进行3次独立实验。2.p202特异性si RNA转染J774A.1细胞和实验分组:应用p202特异性si RNA转染J774A.1细胞,从而得到p202沉默的J774A.1巨噬细胞（S+）;应用无关si RNA（Stealth negative control LO GC）转染J774A.1细胞,得到模拟沉默对照细胞（S-）;用MCMV Simth毒株分别感染S+和S-细胞（MOI=1）,即为S+/V+组和S-/V+组,同时设立模拟感染对照组,即S+/V-组和S-/V-组;3.MCMV感染p202预沉默的J774A.1细胞后AIM2炎性体及下游分子的基因转录和蛋白表达水平:在感染/模拟感染后6h、12h和24h收集上述四组细胞样本,提取总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR法检测p202、AIM2、caspase-1和IL-1β的转录水平的表达;应用蛋白印迹法检测p202、AIM2、pro-caspase-1、p20（活化caspase-1片段）、pro-IL-1β和IL-1β蛋白水平的表达,共进行3次独立实验;4.用免疫荧光法检测p202沉默/模拟沉默状态下MCMV感染后J774A.1细胞内p202和AIM2蛋白表达与分布情况。共进行3次独立实验;5.p202预沉默对MCMV感染的细胞内EA蛋白表达的影响:在感染MCMV后6h、12h和24h,分别收集S+/V+组和S-/V+组细胞爬片,采用免疫荧光法检测细胞内MCMV EA表达情况。共进行3次独立实验。【结果】1.MCMV感染后p202转录和蛋白水平表达增加（1）在未感染细胞内p202 m RNA表达稳定维持在低水平;在MCMV分别感染J774A.1细胞和RAW264.7细胞后,细胞内p202 m RNA和蛋白表达水平较模拟感染组均明显增加（P0.05）。但在S-V+组细胞,caspase-1在MCMV感染后6h明显活化,12h和24h较感染后6h活化减少,但仍高于模拟感染组。而S+V+组在感染后6h、12h和24h caspase-1的活化均高于对应的S-V+组（6h:P<0.01,12h:P<0.05,24h:P<0.05）;（5）pro-IL-1β和IL-1β表达:在感染后6h、12h和24h,S+V+组pro-IL-1β均高于对应的S-V+组（均P<0.05）。与pro-IL-1β表达变化一致,成熟IL-1β在MCMV感染后6h升高,持续至感染后24h,且在感染后6h、12h和24h,S+V+组IL-1β表达均高于对应的S-V+组（6h:P<0.05,12h:P<0.01,24h:P<0.05）。4.p202预沉默对感染细胞内MCMV EA蛋白表达的影响MCMV感染后6h,J774A.1细胞内MCMV EA已有表达,且其表达量在12h和24h明显增加（P<0.01）。此外,MCMV感染后6h和12h时,p202沉默组（S+V+）细胞内MCMV EA表达量明显低于对应的模拟沉默（S-V+）组（P0.05）。【结论】1.MCMV在感染早期诱导AIM2炎性体活化,同时明显促进p202转录和蛋白表达。2.在J774A.1巨噬细胞,p202可抑制AIM2炎性体通路活化。3.p202可能通过抑制AIM2炎性体活化而促进MCMV病毒增殖,参与病毒持续性感染和免疫逃逸机制。
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