禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)属于正黏病毒科,禽流感病毒属。禽类是禽流感病毒的易感宿主,但部分亚型的禽流感病毒也可以感染人。在家禽中流行的部分H5亚型流感病毒属于高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza,HPAI),对人类健康和禽类养殖业均带来严重威胁和巨大挑战,因此,研究并认识禽流感病毒致病机制,对流感病毒防控具有重要理论指导意义。禽流感病毒与宿主蛋白之间的相互作用是病毒复制和致病的关键环节,近20年来,大量研究结果阐述了人源宿主因子在流感病毒生命周期中发挥关键作用。然而,人们对禽源宿主因子在流感病毒复制过程中的作用了解甚少。对此,本研究采用免疫沉淀-质谱联用法,挖掘与流感病毒互作的禽源宿主因子,结果发现鸡的CCT5蛋白(一种含有TCP1亚基5的胞质伴侣蛋白)与禽流感病毒NP和PB2有直接相互作用。进一步的研究表明,病毒感染显著促进DF-1(鸡胚成纤维细胞)内CCT5的表达水平,上调的CCT5反过来促进NP蛋白的核输出,进而促进禽流感病毒的增殖。综上结果,显示禽类CCT5在支持禽流感病毒复制方面具有重要作用。本课题的主要研究内容如下:1.免疫沉淀-质谱联用技术筛选与病毒蛋白互作的禽源宿主因子本研究构建了p CAGGS-HA-NP质粒转染DF1细胞,在用流感病毒H5N6感染表达了NP蛋白的DF1细胞后,通过免疫沉淀技术特异性NP抗体垂钓互作蛋白,利用SDS-PAGE电泳并进行银染,找到差异蛋白,并对差异蛋白条带进行蛋白质谱分析,鉴定了72个潜在的NP蛋白互作宿主因子。与文献报道的NP互作蛋白进行筛查比对,发现CCT5,FARSA,MTHFD1L,NOP56和RUVBL1五个蛋白有可能与NP蛋白互作。接下来本研究利用si RNA分别沉默这五个候选宿主因子,检测其对流感病毒NP蛋白及m RNA含量的影响。结果显示,CCT5,FARSA,MTHFD1L三个基因的沉默对流感病毒NP蛋白的表达都具有明显的抑制作用,其中,CCT5基因沉默对NP/PA/PB2表达量的抑制效果最为明显。2.构建CCT5表达质粒、验证CCT5与病毒结构蛋白的互作关系实验中克隆了禽源CCT5基因,并将其连接到p3Xflag载体上,将其与HANP/PB2表达质粒共转染到DF1细胞中,通过免疫共沉淀技术分别使用HA,Flag抗体相互垂钓并检验互作关系;单独表达CCT5-Flag蛋白感染病毒后使用内源性抗体CCT5和NP/PB2相互垂钓。同时免疫荧光技术验证了这一结果,CCT5与NP、PB2蛋白无论是过表达还是在感染流感病毒条件下都会产生互作,因此有这样一种猜测,即CCT5可能是NP、PB2蛋白的配体,并参与流感病毒的复制过程。3.验证CCT5与流感病毒复制的关系根据荧光定量的结果说明,si-CCT5对流感病毒NP、PA、PB2蛋白的表达都具有明显抑制作用,使用流式分析方法后发现,CCT5沉默的DF1细胞能够抑制带GFP荧光标记的H5N6流感病毒的复制,后续的结果表明,CCT5的表达量随H5N6以及H1N1(HM/DW)流感病毒感染时间以及感染梯度的增加而增殖,这说明流感病毒促进了CCT5的表达。当研究CCT5对流感病毒RNA生成的影响时,发现CCT5的沉默能够抑制流感病毒RNA的合成,反之,CCT5表达能够促进流感病毒RNA的合成。为了进一步证实,实验采用间接免疫荧光实验证实CCT5与NP在细胞中存在共定位,并对NP蛋白的出核起到促进作用。