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前言： 米诺环素(盐酸二甲胺四环素，minocycline hydrochloride)为第二代人工半合成四环素类抗生素，其抗菌谱与四环素相似。米诺环素口服后迅速被吸收，脂溶性较高，组织穿透性好，可以通过血脑屏障作用于中枢神经系统。近年表明，在脑缺血、脑外伤、阿尔茨海默氏病和帕金森病模型上，米诺环素均有显著的神经保护作用。其中，在全脑和局灶性脑缺血模型上，发现四环素类抗生素具有减少梗死面积等脑保护作用，治疗时间窗较传统的抗脑缺血药物更长，其中米诺环素的作用最强；米诺环素的神经保护作用与其抗菌作用无关。目前，已报道该类药物神经保护作用的一些机制，但脑缺血损伤发生时，多条通路都被激活，而米诺环素在各种模型上均表现出了神经保护作用，因此其抗脑缺血的作用环节尚待阐明。谷氨酸是脑内最主要的内源性兴奋性氨基酸，其受体主要包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体等几种亚型。脑缺血、脑外伤与慢性退行性神经疾病等病理过程中，谷氨酸通过激动其突触后膜谷氨酸受体产生兴奋性毒性，参与神经元损害，尤其NMDA受体介导的兴奋性毒性是神经元早期缺血性损伤的重要机制。NMDA受体亦可介导缺血性脑损伤病理中神经胶质细胞活化及产生损伤性物质(如iNOS，ICE等)释放。米诺环素的神经元保护作用可能与其抑制神经胶质细胞活化及损伤性物质释放有关，但米诺环素抑制NMDA受体介导直接效应还是中间环节介导间接效应，未见报道。浙江大学硕士学位论文目的:(l)建立神经元缺氧缺糖(OGD)模型。(2)在大鼠大脑皮层神经元和海马脑片OGD和NMDA损伤模型上，观察米诺环素的保护作用，并分析其作用环节(着重探讨与NMDA受体的关系)。(3)探讨米诺环素的保护作用时间依赖特点。方法: (l)建立神经元OGD模型:以常规方法原代培养新生大鼠皮层神经元，神经元培养至]0一12d用于实验。以平衡盐缓冲液替换细胞培养液放入气密罐，罐中充以95%N:和5%CO:的混合气体，体外模拟缺血过程。测定OGD不同时间对细胞造成的损伤，观察形态学变化，并检测MTT还原产物评价神经元活性;用阳性药物依达拉奉和神经生长因子评价此模型有效性。 (2)在神经元OGD模型和NMDA损伤模型观察米诺环素的作用:观察米诺环素对损伤后神经元形态变化及神经元活性(MTI，法)的影响;NMDA受体拮抗剂MK一801作为对照药。在神经元OGD处理前后不同时间点加入米诺环素，考察米诺环素的治疗时间窗。 (3)在大鼠海马脑片OGD和NMDA损伤模型观察米诺环素的作用:以透光性改变评价大鼠海马脑片活性变化，在OGD或NMDA处理10 min及复灌期间，观察米诺环素或MK一801对脑片透光性变化的作用。数据以牙士、表示，用方差分析检验差异的显著性，以SPSSfo:Window 10.0进行统计学处理。结果: (l)神经元OGD过程中氧分压及葡萄糖浓度变化:OGD 45 min后，缺氧盒中平衡盐缓冲液的poZ从(一52士5)mmHg(对照)降至(29士一)mmHg(n=5，尸<0.0一);密闭sh后重复测定，对照为(一61士4)mmHg，000组为(25土2)mmHg(n=5，尸<0.0一)。oGD组葡萄糖含量无法测到，对照组为(l .63土0.27)叭(n二5)。证明实验条件符合缺氧缺糖。随OGD处理时间增加，MTT试验的光密度(oD49。)逐步降低，3h开始出现显著的损伤(尸<0.001);OGD sh处理后，损伤作用更明显。阳性对照药神经生长因子和依达拉奉浓度依赖性提高OD49。，其中0.01、0.1、l、10林mol几作用显著(尸<0.01)。浙江大学硕士学位论文 (2)米诺环素对神经元OGD及NMDA损伤的作用:米诺环素1、10拼mol几对皮层神经元OGD 3h后再灌24h损伤有保护作用;10、100林mol/L对NMoA(50林molzL，3h)诱导的皮层神经元损伤有保护作用;NMDA受体拮抗剂MK一801(1抖mol几)对两种损伤都有保护作用。进一步考察米诺环素的治疗窗，结果显示OGD 3h后再灌Zh加入米诺环素10件mol/L依然具有神经元保护作用。 (3)米诺环素对海马脑片OGD及NMDA损伤的作用:OGD损伤使海马脑片放射层透光度(LT)显著增加;MK一801(l抖mol/L)可显著抑制OGD引起的LT峰值增高(尸<0.05);米诺环索。一、1、一0林mol/L则无显著作用(尸>0.05)。NMDA(100林mol/L)也使海马脑片放射层透光度(LT)显著增加，MK一8011林mol几显著抑制LT峰值增高(尸<0.05);米诺环索l、10、100卜mol/L无显著作用(尸>0.05)。结论: (l)本实验建立了在%孔板基础上的原代皮层神经元OGD损伤模型。OGD对神经元的损伤作用有明显的时间依赖关系，随着OGD时间增加和再灌时间的延长，其损伤作用增强。阳性药神经生长因子和依达拉奉对OGD损伤有显著的保护作用，证明本实验建立的OGD损伤模型是有效的。该模型为今后高效率筛选抗脑缺血药物提供了简便的方法。 (2)以OGD和NMDA诱导大鼠原代神经元24h后的损伤以及海马脑片即刻损伤。米诺环素对相对缓慢发生的神经元损伤有浓度依赖性保护作用，对海马脑片的即刻损伤作用不明显:说明米诺环素的作用不是通过拮抗NMDA受体，而是影响一些损伤的中间环节。 (3)米诺环素在OGD 3h?