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金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,尽管真菌杀虫剂安全,无环境污染,但却存在着杀虫速率缓慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。昆虫病原真菌致病机制的研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。真菌突破昆虫表皮障碍侵入寄主血淋巴后,病原真菌侵入昆虫体后主要在血腔内生长增殖,以虫菌体等形式存在于寄主体内血淋巴中,直到寄主死亡。多数昆虫病原真菌能够迅速穿透昆虫体壁,通常在24 小时左右就能够侵入寄主体内,但是,需要一周甚至更长的时间才能使昆虫致死。因此,研究病原真菌在侵入昆虫体内后使寄主致死的机制具有重要意义。弄清病原真菌在侵入昆虫体内后的基因表达情况是致病机制研究的重要内容。从感病昆虫体内直接获取病原真菌菌体,以分离和克隆绿僵菌侵入蝗虫体内后表达的基因,对于研究它们在致病机理中的作用具有非常重要的意义。本文采用正交实验方法,对东亚飞蝗(Locusta migratoria)血细胞裂解及其DNA 和RNA 降解的条件进行了优化。在优化条件下,不仅去除了感病东亚飞蝗血淋巴中的血细胞及DNA 和RNA,而且成功地分离和纯化了绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌体。为后续分离和克隆绿僵菌在蝗虫体内表达的基因,研究它们在致病机理中的作用奠定了基础。主要研究结果如下: 1.对蝗虫引物及绿僵菌引物进行PCR 灵敏度分析。结果为:蝗虫特异引物1、2 能检测出0.1pg 的蝗虫DNA,绿僵菌特异性引物3、4 能检测出1pg 绿僵菌DNA。2.通过正交实验方法,对东亚飞蝗(Locusta migratoria)血细胞裂解及其DNA和RNA降解的条件进行了优化,得出最佳酶解条件为:蛋白酶K的浓度为1mg/ml,作用温度为26℃,时间为60min,脱氧核糖核酸酶(DNAase I)的用量为5U,核糖核酸酶(RNAase A)的浓度为0.5mg/ml,核酸酶作用时间为35min,温度为30℃。3.根据正交试验方案得出的最佳酶解条件组合,按照蝗虫血细胞裂解及DNA和RNA 降解的方法处理感病蝗虫血淋巴,得到的细胞沉淀,按照真菌基因组DNA 提取的方法提取DNA,用绿僵菌特异引物和蝗虫特异引物通过PCR 及RT-PCR 反应进行验证。结果表明,从绿僵菌侵染后的蝗虫血淋巴中分离到的绿僵菌菌体中无蝗虫DNA 和RNA 的污染