研究背景:银屑病是一种以角质形成细胞过度增殖和免疫细胞浸润为特征的慢性炎症性皮肤病,由遗传、环境和免疫等多种因素共同作用导致形成。世界范围内发病率是1%-3%,并呈持续增长趋势。约3%-10%银屑病患者表现出炎症性皮损。另外,银屑病并发的关节炎、非酒精性脂肪肝、骨关节病、心血管病和代谢综合征等严重疾病更增加了患者的生理、心理和经济负担。银屑病最常见的类型是寻常型,该类患者特征性的病理改变是表皮处中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils,PMNs)聚集形成的 Munro 微脓疡。Munro微脓疡仅存于角化不全区域,该区角质形成细胞(Keratinocytes,KCs)增生活跃。脓疱型银屑病的炎症特点更为显著,值得一提的是,与寻常型相比,该类型患者表皮的海绵状微脓疡(Kogoj脓肿)中PMNs的浸润尤为明显,KCs的增殖也更显著。这些发现均支持PMNs在银屑病的KCs增殖和炎症反应以及疾病的发生和发展中发挥重要的作用。主要由PMNs合成、储存和释放的中性粒细胞弹性蛋白酶(Nertrophil elastase,NE)是人体一种重要的蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶超家族成员。NE一直是PMNs研究的热点和焦点。中性粒细胞浸润部位的银屑病皮损的增殖速度加快,这可能是由于NE通过表皮生长因子受体EGFR信号通路刺激角质细胞增殖导致的。NE还能促进细胞间粘附分子ICAM-1和炎症因子的表达和分泌,这些病理改变会引起角质细胞增生和分化、血管扩张及炎性细胞浸润到表皮和真皮等改变。ICAM-1是一种在细胞受到内毒素LPS或炎性细胞因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)等刺激时才会大量表达的重要炎症因子,参与PMNs的粘附定植和PMNs与内皮细胞、KCs与T细胞的粘附,在无菌炎症性组织损伤反应中起到了重要的作用。研究发现,在进行期银屑病的皮损处,ICAM-1的释放量明显高于正常对照组;斑块型银屑病患者的血清可溶性ICAM-1 (sICAM-1)的含量在银屑病患者中的水平明显高于健康人,皮损处的ICAM-1表达也大量增加,并且升高的水平与皮损面积正相关。此外,在银屑病患者皮损处和循环中可检测到过度释放的促炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)和白细胞介素-8 (IL-8),并产生级联反应。Trappin-2能够抑制NE的活性并促使其降解,它是内源性NE的一种抑制剂,主要由角质形成细胞及上皮细胞分泌。大量研究显示Trappin-2在炎症性皮肤病及皮肤肿瘤中显著高表达。Trappin-2能够降低IL-6、IL-8和ICAM-1等炎症增强因子的表达,同时抑制角质细胞的增殖。脓疱性银屑病以中性粒细胞浸润为显著特征,Tanaka等研究发现该类患者皮损处NE的表达明显升高,同时进一步研究发现低浓度的NE可以诱导Trappin-2的表达,但当皮损炎症程度加重、NE浓度过高时则抑制Trappin-2的表达,NE/Trappin-2比例升高,比如寻常型银屑病患者皮损处Trappin-2的水平明显高于脓疱型银屑病患者,因此可以根据NE/Trappin-2比例判断银屑病的严重程度。已有的研究表明,NE可以显著促进体外HaCaT角质细胞增殖和代谢,而Trappin-2通过抑制NE活性减缓HaCaT角质细胞的增殖。因此,NE和Trappin-2之间的平衡在银屑病的增殖和炎症反应中起重要作用。目前,已有研究证明对银屑病患者进行早期干预,可以显著降低患者的系统性炎症反应并缓解症状,但银屑病发病机制复杂,所以其靶向药物仍有限。治疗银屑病的主要方法包括常规的全身性治疗(如甲氨蝶呤、阿维A、环孢素和光化学疗法)和生物制剂(如依法利珠单抗、依那西普、英夫利昔单抗和阿达木单抗)和。然而,这些治疗方法存在许多潜在的副作用包括发热、疲劳、皮肤瘙痒和其他症状。目前只有25%的银屑病患者对该病的治疗效果感到满意。除上述问题之外,这些试剂的单靶点部位和高昂的价格也限制了其临床开发和应用。因此,迫切需要进一步开发该病的有效治疗方法。雷公藤多试(Tripterygium wilfordii polycoride, TWP)是一种从传统中药雷公藤中提取的水氯仿提取物,具有免疫抑制、抗炎、抗肿瘤等生物学活性,从而改善机体的炎症状态和免疫功能。目前TWP已被广泛用于自身免疫性疾病和炎症相关的疾病的临床治疗并取得了较为公认的疗效。Meta分析证实雷公藤对进展期的各型银屑病均有效果,但是仍不清楚其发挥治疗作用可能的分子机制。因此,在本文中,我们决定深入研究雷公藤多甙治疗银屑病的作用机制以及NE与Trappin-2的平衡是否也参与其潜在的分子机制中,为雷公藤多甙治疗银屑病的作用靶点提供更充分的科学依据。目的:通过构建两种体外损伤模型,NE诱导的HaCaT细胞增殖模型和TNF-α与NE联合诱导的HaCaT细胞炎症模型,研究雷公藤多甙对HaCaT细胞增殖活力、炎症因子分泌以及ICAM-1表达的影响,探讨其抑制HaCaT细胞增殖和炎症细胞表达的作用机制。方法:1、用不同浓度NE在不同时间下刺激HaCaT细胞,通过比较细胞增殖活力及炎性因子的水平,确定NE的最适作用浓度和时间;分别用不同浓度Trappin-2、TWP在不同时间下对HaCaT细胞进行细胞毒性检测,确定Trappin-2和TWP的最适作用浓度及时间。2、用NE诱导HaCaT细胞增殖模型,观察TWP和Trappin-2干预下,HaCaT细胞增殖的改变。3、用TNF-α和NE联合诱导HaCaT细胞炎症模型,观察TNF-α和NE对HaCaT细胞增殖活力及炎症因子表达的作用;给予TWP和Trappin-2进行干预,观察TWP和Trappin-2的干预作用对模型的影响。4、用CCK-8试剂盒检测HaCaT细胞增殖的变化。5、用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养细胞上清液中白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-8 (IL-8)、NE与Trappin-2蛋白的水平。6、用Western Blot检测细胞内粘附分子-1 (ICAM-1)的表达。结果:1、NE对HaCaT细胞增殖及其炎症因子水平的影响(1) NE以1和10 IU/L的剂量预处理12、24和48 h后HaCaT细胞活力明显增加(P<0.05),但是NE (50和100 IU/L)预处理12、24和48 h后HaCaT细胞活力则显著降低(P<0.05)。(2)NE 在浓度 0.1-100 IU/L 预处理 12、24 和 48 h 后对 HaCaT 细胞的 IL-6、IL-8以及ICAM-1的表达水平略有改变,但与作用时间和浓度无明显相关性,结果无显著差异(P>0.05)。(3)低浓度NE显著增加HaCaT细胞中的Trappin-2水平,高浓度NE降低Trappin-2 水平。因此,选择浓度10 IU/L和刺激时间24h为NE的最适刺激浓度和作用时间。2、Trappin-2对HaCaT细胞增殖的影响10-100ng/ml的Trappin-2处理12 h后HaCaT细胞增殖活力略有变化,结果无显著性差异(P>0.05)。但是,Trappin-2在25-100ng/ml浓度下预处理24或48 h能显著降低HaCaT细胞增殖活力(P<0.05),且该改变呈剂量依赖性。综合以上数据分析,选择浓度25ng/ml和刺激时间24h为Trappin-2最适刺激浓度和最适作用时间。3、TWP对HaCaT细胞增殖的影响与对照组(TWP=0μg/ml)相比,TWP (1-100μg/ml)对HaCaT细胞增殖活力略有改变,结果无显著性差异(P>0.05),表明HaCaT细胞在TWP(<100μg/ml)时没有明显的毒性作用。并且与NE组相比,50μg/ml的TWP处理24h后,能够最大限度地降低NE对HaCaT的增值作用。综上分析,最终确定浓度50μg/ml和刺激时间24h为TWP的最佳刺激浓度和时间。4、TWP/Trappin-2对低浓度NE诱导的HaCaT细胞增殖模型的影响(1) TWP/Trappin-2对低浓度NE诱导的HaCaT细胞活力的影响NE (10IU/L)预处理24h后与对照组相比HaCaT细胞活力明显增加(P<0.01)。此外,TWP和Trappin-2对HaCaT细胞活力没有明显改变(P>0.05)。但是相比于NE组,用TWP (50μg/ml)或Trappin-2 (25ng/ml)处理24h可以显著降低10 IU/LNE处理24 h后的HaCaT细胞活力(P<0.05)。(2) TWP/Trappin-2对低浓度NE诱导的HaCaT细胞中NE和,Trappin-2平衡的影响NE (10IU/L)预处理24h后与对照组相比,HaCaT细胞中NE和Trappin-2水平显著上升(P<0.01)。此外,TWP和Trappin-2对NE和Trappin-2水平未产生明显改变。但是,和NE组相比,用TWP (50μg/ml)或Trappin-2 (25ng/ml)处理24h可以显著下调HaCaT细胞中NE水平并显著上调Trappin-2水平(P<0.05)。因此,HaCaT细胞中NE和Trappin-2的比值和对照组相比显著增加,用50μg/ml TWP或25ng/ml Trappin-2处理24h可以显著降低这个比例(P<0.05)。5、TWP/Trappin-2对TNF-α和联合NE诱导HaCaT细胞炎症模型的影响(1)与对照组相比,TNF-α (10ng/ml)以及TNF-α+NE联合处理HaCaT细胞后,IL-6、IL-8、NE 和 Trappin-2 水平及 NE/Trappin-2 比值显著增加(P<0.05)。(2)与TNF-α组和TNF-α+NE组相比,TWP处理TNF-α+NE联合诱导的HaCaT细胞模型后IL-6、IL-8和NE水平显著降低,Trappin-2水平显著增加(P<0.05)。Trappin-2处理TNF-α+NE联合诱导的HaCaT细胞模型后IL-6、IL-8、NE和Trappin-2的表达与TWP的结果类似(P<0.05)。(3)与对照相比,TNF-α+NE处理后,HaCaT细胞表达ICAM-1蛋白的水平显著增加(P<0.05)。TWP/Trapin-2刺激TNF-α+NE联合诱导的HaCaT细胞模型后,ICAM-1的表达显著降低(P<0.05)。结论:1.低浓度的NE(≤10IU/L)可以显著增加HaCaT细胞活力和Trappin-2水平,而高浓度NE(≥50IU/L)则抑制HaCaT细胞活力,降低Trappin-2的表达。2.在Trappin-2浓度大于25ng/ml,作用时间大于24h的情况下,HaCaT细胞的活力被显著地抑制,并且不随浓度的升高而发生变化。3. TWP浓度≤100μg/ml,作用时间≤48h,HaCaT细胞活力的改变无统计学意义,说明在此条件下,TWP对HaCaT细胞无明显的细胞毒作用,并且不显著改变NE和Trappin-2的表达。4.TWP (50μg/ml)和 Trappin-2 (25ng/ml)处理 24h,可以有效地抑制 NE 诱导的HaCaT细胞增殖,并显著降低NE水平,上调Trappin-2水平以及降低NE/Trappin-2 比值。5. TWP或Trappin-2能明显抑制NE+TNF-α诱导的HaCaT细胞IL-6和IL-8的上调,以及显著降低NE含量和NE/Trappin-2比值,上调Trappin-2水平。此外,TWP或Trappin-2能够下调ICAM-1的蛋白表达。6. TWP对NE/Trappin-2及HaCaT增殖的影响与Trappin-2具有类似的作用,说明TWP可能是Trappin-2的一种潜在激活剂。