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孢子丝菌病(Sporotrichosis)是一种世界范围分布的深部真菌感染,累及皮肤、皮下组织甚至深部脏器,危害较大。我国东北是流行最为严重的地区之一。孢子丝菌病的病原体为申克孢子丝菌复合体,含6种孢子丝菌,我国流行株为球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)。该菌是一种暗色真菌,能够合成大量黑素。黑素是与多种病原真菌的致病性密切相关的毒力因子。但在孢子丝菌相关研究有限,仅发现其能够抑制巨噬细胞的吞噬和氧化杀伤等细胞免疫功能。为进一步阐明孢子丝菌黑素的致病机制,本课题通过UV照射诱导球形孢子丝菌的白化突变株,并提取纯化黑素颗粒melanin ghost,利用体外共培养实验和小鼠感染模型,深入研究了球形孢子丝菌黑素对巨噬细胞抗原呈递功能及CD4+T细胞活化的影响和机制。本研究采用的菌株经过CAL基因测序证实为球形孢子丝菌。UV诱变研究中确定了最佳接种密度为1×103/ml,最佳诱变能量为52×10-3J/cm2~104×10-3J/cm2。该方法获得了性状稳定的白化突变体(MEL-),MEL-菌株除颜色为白色外,其它性状与产黑素野生株(MEL+)高度相似。透射电镜对比两者的超微结构,发现MEL+株细胞壁有大量致密的黑素颗粒覆盖,而MEL-株的细胞壁光滑无黑素。我们通过酶消化-酸煮沸法提取了MEL+菌株孢子中的黑素,获得了melanin ghost(MG)颗粒,每个MG仍保持着原本在孢子中的骨架形态,是中空无其他细胞物质的空壳,代表着一个孢子含有的全部黑素。MG通过多巴染色阳性、棉兰染色阴性和PAS染色阴性、特征性吸光度曲线及TEM鉴定。将MEL-和MEL+菌株通过腹腔注射感染小鼠,21天后MEL+组肺、肝、脾、肾、睾丸均分离到孢子丝菌,而MEL-组仅20%的小鼠在脾和肾中分离到孢子丝菌;MEL+感染的BALB/c小鼠的内脏单位质量真菌载量显著高于MEL-组小鼠。且MEL+小鼠脾脏重量(0.328±0.162g)显著高于MEL-小鼠(0.138±0.028g),说明黑素与球形孢子丝菌的致病性关系密切。将MEL-与MEL+菌株的菌丝相孢子分别与小鼠腹腔巨噬细胞共培养24h,单独培养的巨噬细胞作为对照(Control),以q PCR和流式细胞术检测各组巨噬细胞CIITA及其启动子PI、PIII、PIV表达水平以及细胞表面MHC class II、CD80、CD86等因子水平。MEL-组巨噬细胞CIITA和PIV的相对表达量显著高于MEL+组;Control、MEL+和MEL-组巨噬细胞MHC class II的平均荧光强度(MFI)分别为6010.66±597.74、7524.33±1047.01、10161.67±1205.23(MEL-显著高于MEL+);CD86的MFI分别为4306.00±396.31、9065.67±659.80、11570.00±1004.75(MEL-显著高于MEL+);CD80的MFI分别为12869.00±1746.73、10171.00±1195.26、7469.67±1513.01(MEL-和MEL+无统计学差异),说明球形孢子丝菌黑素能够抑制巨噬细胞的抗原呈递,这一过程中PIV是调节CIITA的主要启动子,而CD86则是主要的共刺激因子。动物模型中,腹腔注射感染21天后分离腹腔巨噬细胞,Control、MEL+和MEL-组巨噬细胞MHC class II的MFI分别为2287.33±55.52、11901.33±904.87、14785.33±1506.12(MEL-显著高于MEL+);CD86的MFI分别为2415.00±404.47、2092.00±136.92、2025.67±99.12(无显著性差异);CD80的MFI分别为14683.33±555.75、7380.67±313.95、5720±163.70(MEL-显著低于MEL+),说明不仅是感染早期,在感染的播散期也存在着抗原呈递功能受黑素抑制。将MEL-和MEL+转换为酵母相后,两者均为白色,TEM下色素产量均很低。分别与小鼠巨噬细胞共培养24h后,Control、MEL+和MEL-三组巨噬细胞的MHC class II MFI分别为6586.33±1435.67、5957.33±904.87、7226.00±518.37,各组间无统计学差异,进一步证实了黑素对抗原呈递的抑制功能。将小鼠巨噬细胞与黑素颗粒melanin ghost(MG)共培养24h,Control组和MG组MHC class II的MFI分别为12766.67±2150.19和12866.67±1594.78,无显著性差异,提示黑素分子本身不能直接下调MHC class II,其抑制抗原呈递功能可能是通过屏蔽细胞壁表面抗原分子来实现的。进一步研究MEL-和MEL+株与巨噬细胞共培养后分泌NO和TNF-α的情况,发现MEL-组培养液上清中NO水平(121.07±6.60μmol/L)显著高于MEL+组(102.50±7.30μmol/L)和Control组(93.27±5.35μmol/L);而TNF-α阳性细胞比例MEL-组(28.63±7.88%)显著高于MEL+组(15.57±3.44%)和Control组(15.50±2.01%)。由于NO和TNF-α为M1(杀伤)型巨噬细胞的标志,提示黑素可以抑制巨噬细胞向M1的极化从而削弱其抗真菌能力。为了验证黑素抑制巨噬细胞抗原呈递功能后,CD4+T细胞的活化是否受到影响,我们将与MEL-、MEL+菌株共培养24h和单独培养24h(Control)的巨噬细胞,分别与CD4+T细胞共培养,使用流式细胞术检测T细胞分泌细胞因子比例的变化。MEL-、MEL+、Control三组T细胞中分泌IL4阳性细胞比例分别为4.77±0.32%、6.67±0.75%、1.86±0.07%(MEL-显著低于MEL+);IFN-γ阳性细胞比例分别为6.90±0.30%、3.34±0.44%、3.59±0.53%(MEL-显著高于MEL+),说明产黑素菌株作用于巨噬细胞后,能导致巨噬细胞诱导CD4+T细胞向Th2方向活化,抑制在抗真菌免疫中最为重要的Th1反应,从而下调巨噬细胞的杀伤能力。由于IFN-γ水平下降,还可以进一步下调巨噬细胞的抗原呈递功能,且这种T细胞参与的下调更加持久,这也是在动物模型中观察到的抗原呈递受抑可以在感染后持续很长时间的原因之一。IL17、Foxp3、IL10、IL2方面,MEL-和MEL+组无统计学差异。综上,球形孢子丝菌黑素可以帮助真菌抑制巨噬细胞的抗原呈递和M1型极化,同时通过影响CD4+T细胞向th2活化来进一步发挥免疫逃逸功能。最后,对MEL-和MEL+菌株进行了蛋白质组学分析寻找差异蛋白,获得了117个候选蛋白。已知的主要毒力因子均不在其中,说明本研究观察到的致病性差异确实为黑素含量不同所致,而非其他毒力因子突变(此结论与酵母相实验的结果相印证)。有趣的是,已知的黑素合成相关因子大多数表达无差异,进一步提示了黑素合成调控的复杂性,可能存在多种辅助调节因子。本研究深入揭示了黑素这一保守而重要的真菌毒力因子在球形孢子丝菌对抗机体免疫细胞过程中的作用机制,阐明了其对巨噬细胞抗原呈递和CD4+T细胞活化的影响,为明确孢子丝菌和机体免疫之间的相互作用提供了新的理论。