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实验背景神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是由于神经系统损害或神经功能障碍引起的一种慢性疼痛。患者长期处于疼痛状态会使焦虑和抑郁率的发生率增加。目前对NP的发病机制研究仍处于探索阶段,临床可用药物的治疗效果有限且大多伴有明显的副作用,其中带状疱疹后神经疼痛较为典型。既往研究认为NP的发生主要与中枢敏化和外周敏化有关。神经炎症反应、氧化应激反应过程中产生的NF-κB、促炎因子以及胶质细胞的活化参与NP过程。研究发现缺血性卒中的神经损伤使神经损伤诱导蛋白2(Ninjurin 2,NINJ 2)表达高度上调;体外培养细胞发现NINJ 2蛋白在周围神经损伤后远端神经节的施万细胞中表达上调,并且通过神经元轴突和施万细胞之间的嗜同性细胞相互作用在背根神经节神经元中促进神经突向外生长;也有研究表明NINJ 2蛋白可能是内皮炎症和激活的新型调节剂,在血管内皮细胞活化和炎症中具有促炎作用。但尚未见相关研究探讨NINJ 2蛋白与神经病理性疼痛的相关性。因此,本实验展开研究,探讨NINJ 2蛋白与神经病理性疼痛的关系及其相关分子机制。实验目的本实验拟采用大鼠坐骨神经分支部分损伤模型(Spared Nerve Injury,SNI),运用Western-blot技术观察SNI大鼠脊髓中NINJ 2蛋白和NF-κB的表达,采用免疫荧光双染的技术观察SNI大鼠脊髓内NINJ 2蛋白是否与NF-κB和神经细胞发生共表达。利用鞘内注射慢病毒技术干扰NINJ 2蛋白的表达,观察其对SNI大鼠疼痛行为学的影响,以及脊髓中NF-κB和促炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表达变化。研究NINJ 2蛋白与NP的关系以及可能存在的作用机制,探索神经病理性疼痛治疗新靶点。实验方法1.雄性SD大鼠随机分为两组:模型组(SNI组,n=8)和假手术组(Sham组,n=8),分别在术前3d、1d及术后1d、3d、5d、7d、10d、14d连续测量大鼠术侧后足机械性缩足阈值(Paw withdrawal threshoid,PWT)。2.雄性SD大鼠随机分为两组:模型组(SNI组,n=15)和假手术组(Sham组,n=12)。分别在术前和术后3d、7d、14d取术侧大鼠脊髓,采用Western-blot技术测脊髓内NINJ 2蛋白、NF-κB的表达水平。在术后14d取大鼠脊髓,用免疫荧光双染技术检测脊髓中NINJ 2蛋白是否和NF-κB以及神经细胞发生共表达。3.雄性SD大鼠随机分为四组:Sham+saline组(n=8),SNI+saline组(n=8),SNI+siRNA组(n=8)和SNI+scrRNA组(n=8)。分别进行鞘内置管术后鞘内注射对应的药物,再过1周后手术建模。分别在术前3d、1d及术后1d、3d、5d、7d、10d、14d测术侧大鼠行为学表现(PWT)。术后14d取各组大鼠脊髓,用Western-blot技术检测NINJ 2蛋白和NF-κB的表达水平;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)表达水平。实验结果1.SNI手术引起大鼠痛觉过敏现象SNI术后大鼠术侧后足产生机械性痛觉过敏。疼痛行为学结果显示术前两组大鼠基础PWT比较未见显著差异;术后3d SNI组大鼠PWT开始发生明显下降,在术后7d降至最低,并持续到术后14d。SNI术后大鼠的PWT出现明显下降,证明SNI大鼠可产生神经病理性疼痛,该模型建造成功。2.SNI术后大鼠脊髓中NINJ 2蛋白和NF-κB表达上调;脊髓内NINJ2蛋白与神经细胞标志物NeuN和NF-κB发生共表达Western-blot结果显示,SNI组术后3d、7d、14d大鼠术侧脊髓中NINJ 2蛋白和NF-κB表达水平升高,以术后第7d表达水平为最高,蛋白表达水平与疼痛行为学变化呈一定相关性,NF-κB的变化趋势与NINJ 2蛋白变化趋势接近;Sham组大鼠脊髓的NINJ 2蛋白和NF-κB表达水平未见显著改变。进行免疫荧光双标染色后发现,NINJ2蛋白与神经元标志物-NeuN和NF-κB发生共表达。3.鞘内注射慢病毒干扰NINJ 2蛋白表达影响SNI大鼠疼痛行为学,调控SNI大鼠脊髓中NINJ2蛋白、NF-kB、促炎因子的表达PWT结果显示,鞘内注射NINJ 2 siRNA干扰NINJ 2蛋白表达可以显著升高SNI大鼠PWT水平,术后3d、5d、7d、10d、14d SNI+siRNA组大鼠PWT均出现上升。术后14d天取大鼠脊髓,Western-blot结果显示,与SNI+Saline组相比,慢病毒干扰NINJ 2蛋白使SNI大鼠脊髓内NINJ 2蛋白和NF-κB表达水平均下降(P<0.05),说明NINJ 2蛋白可能调控NP中NF-κB的表达。ELISA结果显示,与SNI+Saline组相比,SNI+siRNA组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平明显下调,表明NINJ 2蛋白在NP中起促炎作用。结论上述结果提示大鼠坐骨神经选择性损伤可引起大鼠脊髓NINJ 2蛋白的表达上调,NINJ 2蛋白可能通过调控NF-κB、促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达参与神经病理性疼痛。